Plaza genovesa, delante del palacio de Fiesco. Paolo persuade a Pietro para apoyar la candidatura del corsario Simón Boccanegra como duque de Génova. Boccanegra acepta la postulación, creyendo que con esto, Fiesco lo dejará casarse con su hija María (a quien ama profundamente y con quien ha tenido una hija), quien es prisionera de su propio padre en el castillo, porque Fiesco, de familia aristocrática, quiere prevenir esa unión con un plebeyo. Pietro se une al apoyo por Boccanegra. Muere María de tremenda soledad y a causa de su encierro, produciendo en su padre dramáticos lamentos, al darse cuenta de la tragedia que él mismo ha provocado. Boccanegra, que ignora la muerte de María, se acerca a Fiesco a rogarle -una vez más- que lo deje estar con ella y le perdone haber quebrantado su esencia virginal al tener una hija. Fiesco, ocultándole la reciente muerte de su hija, le responde que sólo le tendrá clemencia si Boccanegra lo deja criar a su nieta. Boccanegra le cuenta la imposibilidad de complacerlo, pues su hija desapareció de forma misteriosa hacía algún tiempo. Boccanegra irrumpe en el palacio de Fiesco y encuentra el cuerpo inerte de María, mientras afuera, el pueblo celebra su elección como nuevo duque.

Veinticinco años después. Jardín del palacio Grimaldi. El duque ha desterrado a la mayoría de sus enemigos políticos y ha expropiado sus bienes. En el castillo Grimaldi, Fiesco, ha escondido su identidad haciéndose llamar Andrea Grimaldi, y conspira con enemigos de Boccanegra para expulsarlo del trono. Años antes, los Grimaldi adoptaron a María, la hija de Boccanegra (y nieta de Fiesco), sin conocer este hecho, tras encontrarla huérfana en un convento. La llamaron Amelia Grimaldi, esperando que se convirtiera en la heredera de la fortuna familiar, pues el duque había desterrado a sus hijos. Amelia espera a su amado, Gabriele Adorno, un caballero perteneciente a una familia también enemistada con el duque. Fiesco y Adorno preparan una revuelta contra el duque. Adorno llega y advierte a Amelia de los peligros de la conspiración política. Amelia los previene constantemente contra el odio y la violencia. Llegan noticias de la llegada del duque. Amelia, temiendo que vaya a ser forzada a casarse con Paolo Albiani, canciller del duque, insta a Gabriele Adorno a pedir su mano para casarse. Fiesco acepta la unión, confesando que Amelia fue adoptada por los Grimaldi y no tiene herencia alguna. Gabriele Adorno la quiere de todas formas, y Fiesco los bendice. Boccanegra conoce a Amelia y pide su mano en nombre de Paolo. Perdona a sus hermanos Grimaldi desterrados (como muestra de buena voluntad para unirla a Paolo), pero ella rechaza la unión con Paolo, alegando su origen incierto. Le cuenta a Boccanegra que fue adoptada y, al comparar imágenes que ambos guardan, cada uno en un medallón, se dan cuenta de que ella es su hija perdida. Al fin reunidos, celebran felices este hecho; pero deciden guardarlo en secreto. Cuando Paolo entra, Boccanegra le niega el permiso para casarse. Paolo, furioso, planea con Pietro secuestrar a Amelia.

El Senado entra en sesión. Boccanegra intenta convencer a los senadores de que no declaren la guerra a sus rivales de Venecia, pero su apasionada defensa de la paz no es atendida. Afuera resuenan las voces de la revuelta. El duque es interrumpido por el grito de la muchedumbre que exige su cabeza. Ordena que se abran las puertas, y la aparición de Boccanegra transforma las protestas del pueblo en aclamaciones. La muchedumbre entra, persiguiendo a Adorno. Gabriele Adorno confiesa haber matado a Lorenzino por tratar de secuestrar a Amelia, que le fue ordenado por un alto oficial. Adorno sospecha que ese oficial pudo ser el mismo Boccanegra y está a punto de atacarlo, cuando Amelia intercede y lo detiene. Boccanegra arresta a Adorno esa noche. Sospechando que Paolo es el responsable de haber dado esa orden, destierra al secuestrador anónimo y hace que todos lo maldigan, incluido el propio Paolo, que de esta forma se maldice a sí mismo.

Recámara del duque. Paolo y Fiesco discuten planes para matar a Boccanegra. Fiesco se niega. Paolo le cuenta a Adorno que Amelia es la meretriz del duque, esperando que con esta noticia Adorno mate a Boccanegra. Mientras tanto, vierte veneno en la bebida del duque. Amelia entra y se encuentra con Adorno, quien la acusa de infidelidad. Ella clama amar sólo a Adorno, pero no le explica que Boccanegra es su padre. Éste piensa que el duque mandó matar a su familia. Adorno se esconde al entrar Boccanegra. Amelia le confiesa a su padre que moriría por Gabriele Adorno, con lo que Boccanegra lo perdona. Bebe de la bebida envenenada y se echa a dormir. Adorno sale y trata de matar al duque, pero Amelia lo detiene. Boccanegra despierta y le confiesa que Amelia es su hija. Adorno le pide perdón y promete luchar por su causa.

Paolo es condenado a muerte por liderar un levantamiento en contra del duque. Mientras que Fiesco es liberado de prisión, Paolo le cuenta que ha envenenado a Boccanegra. Fiesco confronta a Boccanegra, quien entra a la sala, ya desfalleciendo. Simón reconoce a su antiguo rival, pero está feliz de contarle que encontró a su hija, nieta de Fiesco. Este siente remordimiento y le cuenta a Boccanegra sobre el veneno. Adorno y Amelia, recién casados, encuentran al padre y abuelo reconciliados. Boccanegra solicita a Adorno ser su sucesor en el trono, y mientras Boccanegra muere, Fiesco lo proclama nuevo duque.