Terrazzo nel palagio Grimani in Venezia. Festa di notte. Un’allegra brigata di giovani cavalieri al soldo della Repubblica Veneta, tra cui Maffio Orsini e l’amico Gennaro, festeggia l’ultima sera trascorsa a Venezia. L’indomani infatti dovranno tutti recarsi a Ferrara, presso la corte di Alfonso d’Este e di Lucrezia Borgia, sua consorte. Il nome di quest’ultima suscita lo sgomento generale: troppo efferati i suoi delitti per non esecrarla. Orsini racconta di una voce misteriosa che durante una battaglia, a Rimini, predisse a lui e a Gennaro la morte per mano della Borgia. Gennaro non gli dà retta e, in disparte, si addormenta. Tutti escono. Intanto approda una gondola dalla quale esce una dama mascherata. È Lucrezia Borgia, giunta in incognito a Venezia per vedere Gennaro, il suo diletto figlio illegittimo, tenuto all’oscuro dei suoi natali. Mentre lo contempla addormentato, non si accorge di essere spiata dal marito e dal di lui braccio destro, Rustighello. Costoro credono il giovane un amante della duchessa. Non ostante gli avvertimenti del suo sinistro confidente Gubetta, Lucrezia si toglie la maschera e bacia la mano del figlio che, svegliatosi, inizia a corteggiare la avvenente dama misteriosa. Poi racconta la sua storia di orfano e il suo amore per la madre che non ha mai conosciuto. Lucrezia consola il giovane, ma viene interrotta dagli amici di Gennaro che rientrano in scena. Invano la duchessa si rimette la maschera e tenta disperatamente di fuggire: Orsini riconosce in lei la nefanda Lucrezia Borgia e tutti la insultano smascherandola davanti a Gennaro che inorridisce.
Una piazza di Ferrara. Il Duca Alfonso medita vendetta e ordina a Rustighello la morte di Gennaro. Quest’ultimo entra in scena pensieroso, rifiutandosi di seguire l’allegra brigata che di lì a poco deve recarsi a una festa in casa della principessa Negroni. Poi sale su un gradino del palazzo ducale e col pugnale stacca la prima lettera dello stemma dei Borgia: il nobile nome si tramuta in orgia. Rimasto solo, Gennaro viene arrestato dagli sgherri del Duca. Sala nel palazzo ducale. Entra Lucrezia che chiede vendetta al marito per il blasone oltraggiato. Per tutta risposta il Duca fa addurre Gennaro, che confessa bellamente il suo reato. La madre disperata cerca invano di difenderlo; poi chiede al consorte un colloquio privato. Prova con lusinghe, preghiere, minacce, ma nulla fa recedere il Duca dal suo proposito di far uccidere Gennaro. Egli concede solo alla donna di decidere se l’amato dovrà morire di veleno o di spada. In uno stato di crudele esitazione, Lucrezia opta per il veleno. Gennaro viene ricondotto da Rustighello e dagli altri sgherri del Duca. Quest’ultimo finge di perdonarlo e l’invita a bere da una coppa che la stessa Lucrezia gli porgerà. Quando tutto è compiuto, il Duca si allontana col suo seguito. Rimasti soli madre e figlio, Lucrezia avverte immediatamente Gennaro che il vino era avvelenato e, consegnandogli un’ampolla con l’antidoto, lo fa fuggire.
Piccolo cortile che mette nella casa di Gennaro. Rustighello con gli sgherri del Duca spia la casa di Gennaro con intenti minacciosi, ma il rumore di una persona che sopraggiunge allontana temporaneamente il pericolo. È Maffio Orsini che riesce a convincere Gennaro ad andare anche lui alla festa a casa della Negroni. I due si allontanano dunque insieme. Gli sgherri vorrebbero inseguirli, ma Rustighello li ferma: il giovane è caduto in una trappola ancora peggiore di quella che stavano preparandogli loro. Sala nel palazzo Negroni illuminata e addobbata per festivo banchetto. La festa è al suo culmine: i giovani cavalieri, ormai ubriachi, siedono a tavola con un gran numero di dame e il sinistro Gubetta, che si è infiltrato tra loro facendosi passare per un avventuriero spagnolo. Costui, per fare allontanare le dame, provoca Orsini e dà inizio a una zuffa che subito viene sedata; il duello non può avere luogo: gli ospiti sono disarmati avendo lasciato le loro spade all’entrata. Un coppiere vestito di nero porta in giro una bottiglia. Tutti bevono tranne Gubetta che versa il bicchiere dietro le spalle e incita Orsini a cantare un brindisi. Durante la canzone, si sentono in lontananza un coro funebre e una campana da morto. All’inizio si pensa a uno scherzo delle dame, ma quando le luci incominciano lentamente a spegnersi tutti si dirigono verso l’uscita della sala che risulta sprangata. Compare di colpo Lucrezia Borgia: la festa è stata da lei organizzata per avvelenare tutti coloro che a Venezia l’hanno oltraggiata. Ma poi riconosce Gennaro tra i presenti e, sconvolta, ordina alle guardie di sgomberare la sala. Rimasta sola con lui, cerca in tutti i modi di convincerlo a bere l’antidoto. Gennaro rifiuta con fermezza: morrà coi suoi amici. Ma non senza averli prima vendicati: egli prende un coltello dalla tavola e si scaglia su Lucrezia. A questo punto, la donna gli rivela la sua vera identità: Gennaro è un Borgia e sta per uccidere sua madre. Il giovane, sgomento e ormai moribondo, si abbandona sopra una sedia e spira tra le braccia di Lucrezia.
