Terrasse du palais Grimani à Venise. Fête nocturne. Toute une joyeuse bande de jeunes chevaliers à la solde de la République de Venise, dont Maffio Orsini et son ami Gennaro, fête leur dernière soirée à Venise. Le lendemain ils devront en effet partir pour Ferrare, auprès de la cour d’Alfonso d’Este et de sa femme Lucrezia Borgia. Au nom de cette dernière, tous sont saisis d’effroi : ses crimes atroces la vouent à l’exécration générale. Orsini raconte qu’une voix mystérieuse, durant une bataille à Rimini, lui avait prédit que lui et Gennaro périraient tous deux de la main de la Borgia. Gennaro ne l’écoute pas et s’endort à l’écart. Tous sortent de scène, tandis qu’une gondole accoste et qu’une femme masquée en descend. Il s’agit de Lucrezia Borgia, arrivée incognito à Venise pour voir Gennaro, son fils illégitime adoré, le quel ignore tout de ses origines. Tandis qu’elle le contemple endormi, elle ne s’aperçoit pas que son mari, accompagné de son bras droit Rustighello, l’épie. Les deux hommes croient que le jeune homme est un amant de la duchesse. Bien que son sinistre confident Gubetta la mette en garde, Lucrezia enlève son masque et embrasse la main de son fils. Celui-ci se réveille et commence à courtiser cette belle dame mystérieuse. Puis il lui parle de son enfance d’orphelin et de son amour pour sa mère qu’il n’a jamais connue. Lucrezia le console mais elle est interrompue par les amis de Gennaro qui entrent à nouveau en scène. En vain cherche-t-elle alors à remettre son masque et à s’enfuir. Orsini reconnaît en elle la sinistre Lucrezia Borgia et tous l’insultent et la démasquent devant Gennaro horrifié.
Une place de Ferrare. Le Duc Alfonso médite sa vengeance et ordonne à Rustighello que Gennaro soit tué. Ce dernier entre en scène, pensif, et refuse de suivre la joyeuse bande de ses amis se rendant à une fête chez la princesse Negroni. Puis il gravit une marche du palais ducal et, à l’aide de son poignard, il fait sauter la première lettre du blason des Borgia: le noble nom se transforme en orgia. Resté seul, Gennaro est arrêté par les sbires du Duc. Salle du palais ducal. Lucrezia entre et crie vengeance pour le blason outragé. Pour toute réponse le Duc fait entrer Gennaro, lequel avoue tranquillement son méfait. Désespérée, sa mère cherche en vain de le disculper, puis elle demande à son mari un entretien privé. Elle essaie par des flatteries, des prières et des menaces de convaincre le Duc à revenir sur sa décision de faire tuer Gennaro. Le Duc lui accorde seulement le droit de choisir si son amant devra mourir par le poison ou le poignard. Après un moment cruel d’hésitation, Lucrezia opte pour le poignard. Gennaro est reconduit sur scène par Rustighello et les sbires du Duc. Le Duc fait semblant de lui accorder son pardon, puis l’invite à boire dans une coupe que Lucrezia elle-même lui tendra. Quand tout est accompli, le Duc s’éloigne avec sa suite. La mère et le fils restent seuls. Lucrezia avertit Gennaro que le vin était empoisonné, lui donne un flacon contenant un antidote et le fait évader.
Petite cour devant la maison de Gennaro. Rustighello et les sbires du Duc, animés de sombres intentions, épient la maison de Gennaro, mais le bruit de pas d’une personne qui s’approche écarte un instant tout danger. Maffio Orsini arrive et réussit à convaincre Gennaro de l’accompagner à la fête qui a lieu chez la princesse Negroni. Les deux jeunes gens s’éloignent ensemble. Les sbires voudraient les suivre mais Rustighello les arrête : le jeune homme vient de tomber dans un piège encore pire que celui qu’ils étaient en train de lui tendre.
Salle du palais Negroni illuminée et décorée pour un banquet de fête. La fête bat son plein : les jeunes chevaliers, à moitié soûls, sont assis à une table parmi un grand nombre de dames et du sinistre Gubetta qui s’est joint à eux en se faisant passer pour un aventurier espagnol. Pour éloigner les dames, Gubetta provoque Orsini et soulève une bagarre qui est toutefois vite apaisée ; le duel ne peut avoir lieu : les invités sont désarmés car ils ont laissé leurs épées à l’entrée. Un échanson vêtu de noir verse du vin aux uns et aux autres. Tous boivent sauf Gubetta qui vide son verre par-dessus ses épaules et qui incite Orsini à chanter pour porter un toast. Tandis que ce dernier chante, on entend au loin un chœur funèbre et un glas. Tout le monde pense d’abord qu’il s’agit d’une plaisanterie préparée par les dames, mais lorsque les lumières commencent lentement à s’éteindre tous se dirigent vers la porte et découvrent qu’elle est barrée. Lucrezia Borgia apparaît soudain : c’est elle qui a organisé la fête pour empoisonner tous ceux qui, à Venise, l’avait insultée. Mais lorsqu’elle reconnaît Gennaro parmi les invités, elle est bouleversée et ordonne aux gardes de faire vider la salle. Restée seule avec lui, elle cherche en vain à lui faire boire l’antidote. Gennaro refuse avec fermeté : il mourra avec ses amis. Non sans les avoir au préalable vengés : il saisit un couteau sur la table et se jette sur Lucrezia. Celle-ci lui révèle alors sa véritable identité : Gennaro est un Borgia et est sur le point de tuer sa mère. Le jeune homme, effaré et désormais moribond, se laisse tomber sur une chaise et expire dans les bras de Lucrezia.
