Terrasse im Palast der Grimani in Venedig. Nächtliches Fest. Eine heitere Gesellschaft junger Kavaliere im Dienst der Republik Venedig – unter ihnen Maffio Orsini und sein Freund Gennaro – genießt den letzten Abend in Venedig. Am nächsten Tag müssen sich alle nach Ferrara begeben an den Hof von Alfonso d’Este und seiner Frau Lucrezia Borgia. Der Name Lucrezias erschreckt alle: zu bekannt sind ihre schweren Verbrechen. Orsini erzählt von einer geheimnisvollen Stimme, die ihm während einer Schlacht bei Rimini voraussagte, er und Gennaro würden durch die Hand der Borgia sterben. Gennaro hört nicht auf den Freund und legt sich – etwas abseits – zum Schlaf nieder. Alle verlassen die Szene. Inzwischen trifft eine Gondel ein, die eine maskierte Dame zum Palast bringt. Er ist Lucrezia Borgia, die in Inkognito nach Venedig gekommen ist um Gennaro zu sehen, ihren geliebten unehelichen Sohn, der jedoch nichts von den Umständen seiner Geburt weiß. Während sie den schlafenden Gennaro betrachtet, wird unbemerkt von ihrem Mann und seinem engsten Gefolgsmann Rustighello beobachtet. Alle halten den jungen Gennaro für den Liebhaber der Herzogin. Lucrezia hört nicht auf die Warnungen ihres verbrecherischen Vertrauten Gubetta, nimmt die Maske ab und küsst die Hand des Sohnes. Dieser erwacht und umwirbt die geheimnisvolle schöne Dame. Er erzählt, er sei Waise und liebe seine Mutter, obwohl er sie nie gekannt habe. Lucrezia tröstet ihn, aber sie wird durch das Erscheinen der Freunde Gennaros unterb rochen. Die Herzogin legt ihre Maske wieder an und versucht zu entfliehen, aber umsonst. Orsini erkennt in ihr die verbrecherische Lucrezia Borgia: ihr Name wird enthüllt und alle beleidigen sie, in Anwesenheit Gennaros, der tiefen Schrecken empfindet.
Ein Platz in Ferrara. Der Herzog Alfonso sinnt auf Rache: Rustighello erhält den Befehl, Gennaro zu töten. Dieser erscheint in Gedanken versunken und weigert sich, die fröhliche Gesellschaft zu einem Fest im Palast der Prinzessin Negroni zu begleiten. Dann steigt er eine Stufe des herzoglichen Palastes hinauf und löst mit seinem Dolch den ersten Buchstaben aus dem Wappen der Borgia: der Name der adligen Familie verwandelt sich in orgia. Die Wachen des Herzogs verhaften Gennaro. Ein Saal im herzoglichen Palast. Lucrezia erscheint bei ihrem Gatten: die Beleidigung des Wappens muss gerächt werden. Der Herzog antwortet nicht und lässt Gennaro hereinführen, der seine Tat ohne Probleme zugibt. Vergeblich versucht Lucrezia, seine Mutter, ihn zu verteidigen; dann verlangt sie, mit ihrem Mann unter vier Augen zu sprechen. Sie versucht es mit Schmeicheleien, Bitten und Drohungen, aber nichts kann den Herzog von seinem Vorhaben abbringen: Gennaro muss sterben. Lucrezia kann nur die Art des Todes des Geliebten wählen: das Schwert oder das Gift. Eine grausame Zumut u n g. Lucrezia zögert und wählt dann das Gift. Gennaro wird von Rustighello und den anderen Schergen des Herzogs zurückgebracht. Der Herzog gibt vor, verziehen zu haben und lädt ihn ein, aus dem Pokal zu trinken, den Lucrezia selbst ihm reichen wird. Als dies geschehen ist, entfernt sich der Herzog mit seinem Gefolge. Mutter und Sohn bleiben allein. Lucrezia gesteht Gennaro sofort, dass der Wein vergiftet war. Sie steckt ihm eine Ampulle mit einem Gegengift zu und lässt ihn entfliehen.
Kleiner Hof, der zum Hause Gennaros führt. Rustighello und die Leute des Herzogs beobachten das Haus Gennaros. Ihre Absichten sind nicht friedlich, aber das Erscheinen eines Mannes bannt vorübergehend die Gefahr. Der Mann ist Maffio Orsini, der Gennaro überreden kann, mit ihm zum Fest der Negroni zu kommen. Die beiden entfernen sich zusammen. Die Leute des Herzogs wollen ihnen folgen, aber Rustighello hält sie auf: der junge Kavalier ist in eine Falle gegangen, die sehr viel gefährlicher ist als die, die sie ihm stellen wollten. Saal im Palast der Negroni, festlich geschmückt und beleuchtet. Das Fest ist auf dem Höhepunkt. Die jungen Kavaliere sind betrunken. Mit ihnen am Tisch befindet sich an große Anzahl von Damen. Auch Gubetta hat sich unter die Gäste gemischt und gibt sich als spanischer Abenteurer aus. Um die Damen zu entfernen, fängt er Streit mit Orsini an. Es kommt zu einer tätlichen Auseinandersetzung, die jedoch sofort geschlichtet wird. Das Duell kann nicht stattfinden, denn alle Gäste haben ihre Waffen bei Eintritt abgegeben. Ein schwarzgekleideter Diener schenkt Wein aus einer Flasche aus. Alle trinken, außer Gubetta, der den Wein hinter seinem Rücken ausschüttet, aber Orsini zu einem Trinkspruch auffordert. Während des Trinklieds hört man in der Ferne Totengesänge und den Klang der Totenglocke. Zunächst glaubt man an einen Scherz der Damen, aber als langsam die Lichter ausgehen , begeben sich alle zum Ausgang des Saales, der jedoch versperrt ist. Plötzlich erscheint Lucrezia Borgia: sie hat dieses Fest veranstaltet um alle zu vergiften, die sie in Venedig beleidigt haben. Aber dann entdeckt sie Gennaro unter den Anwesenden und befiehlt den Wachen, den Saal zu räumen. Mit Gennaro allein geblieben, versucht sie, in dazu zu bringen, das Gegengift zu trinken. Gennaro weigert sich entschieden: er wird zusammen mit seinen Freunden sterben. Aber zuerst wird er sie rächen. Er nimmt ein Messer vom Tisch und stürzt sich auf Lucrezia. Nun endlich gibt sie sich zu erkennen: Gennaro ist ein Borgia und eben dabei, seine Mutter zu töten. Der junge Kavalier bricht auf einem Stuhl zusammen. Das Gift tut seine Wirkung, und er stirbt in den Armen Lucrezias.
