La Chiesa di Sant’Andrea della Valle, Roma, giugno 1800. Da poco evaso dalle carceri di Castel Sant’Angelo, il prigioniero politico Cesare Angelotti si è rifugiato nella cappella di famiglia della sorella, la marchesa Attavanti. Il pittore Mario Cavaradossi, intento a dipingere l’immagine di Maria Maddalena – alla quale ha dato il volto della Attavanti, da lui scorta più volte nella cappella – ha riconosciuto e soccorso Angelotti, di cui condivide la fede rivoluzionaria. Tuttavia, l’improvviso sopraggiungere della celebre cantante Floria Tosca, amante di Cavaradossi, ha costretto il fuggiasco a nascondersi nuovamente nella cappella. All’evidente imbarazzo di Mario, Tosca si insospettisce. Il suo dubbio e la sua gelosia accrescono quando riconosce nel dipinto il volto della marchesa Attavanti, che ella crede sua rivale in amore. Ma l’amato la tranquillizza e, per congedarla rapidamente, le dà un appuntamento per quella stessa notte alla sua villa. Non appena Tosca si allontana, Cavaradossi fugge con Angelotti. Nel frattempo, l’evasione è stata scoperta e il capo della polizia, il temuto barone Scarpia, è giunto in chiesa sulle tracce del prigioniero. Da alcuni indizi significativi egli ha compreso che A ngelotti è fuggito, aiutato da Cavaradossi. Insospettita dall’assenza dell’amato e irritata dalle insinuazioni di Scarpia, Tosca, credendosi tradita, si precipita verso la villa di Cavaradossi. Il capo della polizia ordina al suo agente Spoletta di seguirla. Indi, partecipa al solenne rito del Te Deum, pregustando la morte di Cavaradossi e l’amore di Tosca.
La camera di Scarpia al piano superiore di Palazzo Farnese. In attesa di notizie sulla cattura dell’evaso, Scarpia sta cenando nella sua camera. Dalle stanze del palazzo giunge l’eco di una festa di corte dove si sta esibendo Floria Tosca. Dopo avere interrogato Cavaradossi che ha negato di conoscere il nascondiglio di Angelotti, Scarpia ne chiede notizia a Tosca, la quale, tuttavia, elude abilmente le sue insidiose domande. Ma alle urla di Mario, messo sotto tortura nella stanza vicina, la donna non riesce più a mentire e rivela il nascondiglio dell’evaso. Ricondotto sanguinante nella stanza di Scarpia, Mario comprende che Tosca non ha taciuto e, disperato, la maledice. Alla notizia della vittoria di Bonaparte, Cavaradossi inneggia alla libertà, prima di essere trascinato in carcere. Rimasto solo con Tosca, Scarpia le offre brutalmente la vita dell’amato in cambio di una notte d’amore. La donna dapprima rifiuta, poi, alla notizia del suicidio di Angelotti e dell’imminente fucilazione di Mario, cede al ricatto. Scarpia le fa credere, allora, di predisporre una falsa fucilazione per salvare Cavaradossi, ma contemporaneamente ordina a Spoletta un’esecuzione regolare. Consegnato a Tosca un lasciapassare che le consentirà di partire liberamente dallo Stato Pontificio con il suo amato, Scarpia si avventa su di lei. M a Tosca lo uccide con un coltello e si allontana, dopo essersi impossessata del lasciapassare.
La piattaforma di Castel Sant’Angelo. In attesa della fucilazione, Cavaradossi rimpiange i momenti d’amore trascorsi con Tosca. Ma i ricordi malinconici sono presto interrotti dal sopraggiungere dell’amata che gli mostra il lasciapassare con cui potranno fuggire e poi gli confessa l’omicidio di Scarpia. Prima di allontanarsi, Tosca illustra a Mario la messinscena della falsa fucilazione cui egli dovrà sottostare. Come se assistesse a una scena teatrale, Tosca dirige da lontano la morte di Mario. Ma ben presto ella comprende che la fucilazione è realmente avvenuta. Al sopraggiungere delle guardie che hanno ormai scoperto l’assassinio del capo della polizia, Tosca disperata sale sul parapetto e si lancia nel vuoto, invocando per Scarpia la punizione divina.
