Église Sant’Andrea della Valle, Rome, Juin 1800. Le prisonnier politique Cesare Angelotti, évadé des geôles du Château Saint-Ange, s’est réfugié dans la chapelle de famille de sa soeur, la marquise Attavanti. Le peintre Mario Cavaradossi, chargé d’y peindre le visage de Marie-Madeleine – à laquelle il a donné les traits de la marquise, qu’il a souvent aperçue dans la chapelle – a reconnu le fugitif, dont il partage les idées révolutionnaires, et lui offre son aide. Toutefois l’arrivée inattendue de la célèbre cantatrice Floria Tosca, amante de Cavaradossi, contraint Angelotti à rentrer dans sa cachette. L’attitude embarrassée de Mario éveille les soupçons de la jeune femme et ceux-ci augmentent lorsqu’elle reconnaît dans le visage peint sur le mur celui de la marquise Attavanti, qu’elle croit être sa rivale. Mais son amant la tranquillise et, pour l’éloigner au plus vite, lui fixe un rendez-vous pour la nuit même dans sa villa. Dès que la Tosca s’éloigne, Cavaradossi s’enfuit avec Angelotti. Entre-temps l’évasion d’Angelotti du Château Saint-Ange a été découverte et le chef de la police, le redouté baron Scarpia, entre dans l’église sur les traces du fugitif. À certains indices il comprend qu’il vient d’en partir, aidé de Cavaradossi. La Tosca , que l’absence de son amant rend à nouveau soupçonneuse, est irritée par les insinuations de Scarpia. Se croyant trahie, elle se précipite vers la villa de Cavaradossi. Le chef de la police ordonne alors à son agent de la suivre, tandis que lui-même va participer au Te Deum, se réjouissant déjà de la mort de Cavaradossi et de l’amour de la Tosca.
La chambre de Scarpia, au Palais Farnese. En attendant des nouvelles sur la capture du fugitif, Scarpia dîne dans sa chambre. Les bruits de la fête qui se déroule dans d’autres pièces du palais et où chante Floria Tosca arrivent jusqu’à lui. Après avoir interrogé Cavaradossi, lequel nie connaître la cachette d ’Angelotti, Scarpia interroge la cantatrice. Celle-ci évite avec habileté de répondre à ses questions insidieuses mais elle n’hésite plus à révéler la cachette en entendant crier Mario, que l’on torture dans la pièce voisine. Lorsque celui-ci est ramené, couvert de sang, dans la chambre de Scarpia, il comprend que la Tosca a parlé et, désespéré, la maudit. À la nouvelle de la victoire de Bonaparte, Cavaradossi exalte la liberté, avant d’être porté en prison. Resté seul avec la Tosca, Scarpia lui propose brutalement la liberté de son amant en échange d’une nuit d’amour. La Tosca refuse tout d’abord, mais elle accepte le pacte à la nouvelle de la mise à mort imminente de Mario et du suicide d’Angelotti. Scarpia lui fait alors croire que Cavaradossi sera sauvé grâce à une fausse exécution, tandis qu’en même temps il ordonne à Spoletta d’en préparer une véritable. Après avoir remis à la cantatrice un sauf-conduit lui permettant de sortir librement des États Pontificaux avec son bien-aimé, il tente de l’étreindre. Mais la Tosca le tue d’un coup de couteau et s’éloigne avec le sauf-conduit. Troisième acte Terrasse du Château Saint-Ange. Alors qu’il attend d’être fusillé, Cavaradossi repense aux moments d’amour passés avec la Tosca. Ses souvenirs mélancoliques se dissipent toutefois dès qu’apparaît la jeune femme qui lui montre le sauf-conduit grâce auquel ils pourront s’enfuir et qui lui avoue le meurtre de Scarpia. Avant de s’éloigner, elle lui explique la mise en scène de la fausse exécution à laquelle il devra se soumettre. Comme si elle assistait à une œuvre théâtrale, la Tosca dirige de loin la mise à mort de Mario. Mais bien vite elle comprend que l’exécution a bel et bien eu lieu. À l’arrivée des gardes qui ont découvert le meurtre du chef de la police, la Tosca, en proie au désespoir, monte sur le parapet et se jette dans le vide, invoquant contre Scarpia la punition divine.
