In der Kirche von Sant’Andrea della Valle, Rom, Juni 1800. Der politische Häftling Cesare Angelotti ist gerade aus dem Gefängnis in Castel Sant’Angelo entflohen und hat sich in der Kapelle der Attavanti, der Familie seiner Schwester, versteckt. Der Maler Mario Cavaradossi hat den Auftrag, für die Kirche das Bild der Maria Magdalena zu malen. Er gab der Heiligen die Züge der Marchesa Attavanti, die er mehrere Male in der Kapelle beobachtet hatte. Cavaradossi erkennt und hilft Angelotti, dessen politische Einstellung erteilt. Jedoch ganz unerwartet erscheint die berühmte Sängerin Floria Tosca, die Geliebte Cavaradossis, und zwingt den Flüchtling sich von neuem zu verstecken. Die offensichtliche Unruhe Marios macht Tosca misstrauisch. Ihr Zweifel und ihre Eifersucht scheinen ihr bestätigt, als sie auf dem Gemälde die Züge der Attavanti erkennt, die sie für ihre Rivalin hält. Aber der Geliebte beruhigt sie, und um sie möglichst rasch zu verabschieden, verabredet er sich mit Tosca für dieselbe Nacht in seiner Villa. Kaum hat sich Tosca entfernt, enteilt auch Cavaradossi mit Angelotti. In der Zwischenzeit ist die Flucht entdeckt worden und der Chef der Polizei, der gefürchtete Baron Scarpia, ist auf den Spuren des Flüchtlings in die Kirche gekommen. Einige wichtige Indizien zeigen klar, dass Angelotti dank Cavaradossis Hilfe weiterkommen konnte. Misstrauisch, dass Cavaradossi seine Arbeit im Stich gelassen hat und erzürnt über die boshaften Unterstellungen Scarpias, glaubt sich Tosca betrogen und eilt zur Villa Cavaradossis. Der Polizeichef befiehlt seinem Agenten Spoletta ihr zu folgen. Dann nimmt er an dem feierlichen Te Deum teil, denkt aber mit diabolischer Freude an die Ereignisse, die kommen werden: der Tod Cavaradossis und die Liebe Toscas für ihn, Scarpia.
Das Zimmer Scarpias im oberen Stockwerk des Palazzo Farnese. Scarpia diniert in seinem Zimmer. Er wartet auf Nachrichten über die Verhaftung des Flüchtlings. Aus dem Saal der Königin, durch das Fenster, dringt die Stimme von Floria Tosca, die auf einem Fest des Hofes singt. Nachdem Scarpia dann Cavaradossi verhört hat, der nicht zugibt, das Versteck des Angelotti zu kennen, wendet sich Scarpia mit seinen Fragen an Tosca, die ihm jedoch auf eleganter Weise ausweicht. Aber als man die Schreie Marios hört, der im Raum nebenan gefoltert wird, verliert Tosca die Nerven und enthüllt das Versteck des Flüchtlings. Als Mario – geschlagen und blutig – in das Zimmer Scarpias geführt wird, begreift er sofort, dass Tosca ihr Schweigen gebrochen hat. In seiner Verzweiflung verflucht er sie, und als die Nachricht kommt, dass Bonaparte in der wichtigen Schlacht gesiegt hat, bricht er in Jubel aus und besingt die Freiheit. Man schleppt ihn fort ins Gefängnis. Mit Tosca allein geblieben schlägt Scarpia brutal seinen Handel vor: eine Liebesnacht für das Leben des Geliebten. Tosca weigert sich, aber dann kommt die Nachricht vom Selbstmord Angelottis und von der sofortigen Exekution des Malers. Sie fügt sich dem Erpresser. So befiehlt Scarpia die – anscheinend – nur simulierte Hinrichtung Cavaradossis. Gleichzeitig erhält Spoletta den Befehl zur Hinrichtung durch Erschießen. Tosca erhält auf ihren Wunsch einen Pass, mit dem sie frei den Vatikanstaat verlassen kann, zusammen mit ihrem Geliebten. Dann will Scarpia sich auf sie stürzen. Aber Tosca tötet ihn mit einem Messerstich. Sie nimmt dem Toten den Pass aus der Hand und verlässt den Palazzo.
Auf der Plattform des Castel Sant’Angelo. Cavaradossi steht kurz vor der Exekution und denkt an die glücklichen Momente mit Tosca. Seine Erinnerungen werden bald von dem Erscheinen der Geliebten unterbrochen. Sie zeigt ihm den Pass: die Rettung; dann gesteht sie, Scarpia erstochen zu haben. Bevor sie sich entfernt, gibt sie Mario genaue Anweisungen, wie er sich bei der fingierten Hinrichtung zu verhalten habe. So als stehe sie auf der Bühne eines Theaters, erlebt Tosca den Tod Marios. Aber schnell begreift sie, dass sie betrogen wurde. Als die Wachen erscheinen, die den Tod des Polizeichefs nunmehr entdeckt haben, steigt sie auf die Brüstung der Plattform und springt in die Tiefe: Gott wird Scarpia für seine Taten strafen.
