Un prato vicino ad un lago, nei tempi delle favole. La ninfa delle acque Rusalka è seduta, malinconica, sul bordo del lago, mentre le altre ninfe ballano e cantano. Lo gnomo delle acque Vodník le chiede la causa della sua tristezza e Rusalka gli risponde di essere innamorata di un umano, un principe, da quando egli è venuto a nuotare nel lago. Ora vorrebbe diventare umana per vivere con lui sulla terra. Inorridito dalla confessione, Vodník l’avvisa che gli uomini sono diabolici e pieni di peccati. Rusalka insiste che invece sono pieni d’amore. Lo gnomo le spiega che l’unica ricetta per diventare umana appartiene alla strega delle acque, Ježibaba. Poi, rattristito, si ritira nel lago. Rusalka chiede alla luna di mandare un messaggio d’amore al principe. Entra Ježibaba, che accetta di trasformare Rusalka in donna, ma l’avvisa che se non trovasse l’amore, sarà dannata per l’eternità, e l’uomo che ama sarà condannato a morire. Inoltre, diventando umana, perderà il dono della voce. Convinta che l’amore sia più forte di qualsiasi incantesimo, Ruslaka beve dalla pozione magica portagli da Ježibaba. Al montare del sole, il principe appare con una partita di caccia e incontra Rusalka sul bordo del lago. Nonostante la fanciulla non gli porga la parola, il principe è attratto alla sua bellezza e decide di portarla con sé a palazzo. Dal lago sorgono le voci delle ninfe, che lamentano la perdita della sorella.
Al castello del principe, il guardiacaccia e l’aiutante cuoco parlano del matrimonio del principe con la sua nuova e strana fidanzata, di cui nessuno conosce il nome. Entra il principe con Rusalka. Non capisce perché lei sia così fredda nei suoi confronti, ma è determinato a conquistarla. Un’invitata al matrimonio, una principessa straniera, prende in giro il mutismo di Ruslaka e rimprovera il principe d’ignorare i suoi ospiti. Il principe spedisce Rusalka a prepararsi per le nozze e poi accompagna la principessa nella sala d’onore, dove la festa ha appena avuto inizio. Vodník appare nella piscina del giardino inabitato del palazzo. Rusalka, presa dal panico e spaesata in questo luogo ostile, corre dal palazzo in lacrime. Ritrovando la sua voce, prega Vodník di aiutarla, confessandogli che il principe non la ama più. Il principe e la principessa straniera passeggiano nel giardino, e il principe gli confessa il suo amore. Rusalka interviene e si getta tra le braccia del principe, che però la respinge. Vodník gli svela il destino che lo aspetta, la morte, e poi sparisce nel lago trascinandosi dietro Rusalka. Il principe chiede aiuto alla principessa, che gli ride in faccia dicendogli di seguire la sua sposa fino all’inferno.
Rusalka è seduta sul bordo del lago e si lamenta del suo destino. Ježibaba appare e la prende in giro, poi le porge un pugnale e le ricorda che esiste una soluzione molto semplice per salvarsi: uccidere il principe. Rusalka rifiuta e getta il pugnale nell’acqua. Le sue sorelle l’abbandonano e Rusalka sprofonda nel lago, disperata. Il guardiacaccia e l’aiutante cuoco vengono a chiedere l’aiuto di Ježibaba. Le spiegano che il principe è stato stregato da una creatura del bosco che lui aveva intenzione di sposare. Improvvisamente Vodník emerge dalle acque insitendo che Ë stato il principe ad aver ingannato Rusalka. Terrorizzati dall’atto soprannaturale, i due fuggono a gambe levate. Appaiono le ninfe del bosco, cantando e danzando. Vodník racconta loro l’accaduto e queste si ammutoliscono, afflitte, poi spariscono. Il principe, disperato e mangiato dal rimorso, emerge dalla foresta, alla ricerca di Rusalka, gridando il suo nome e chedendole di tornare a lui. Rusalka emerge, rinfacciandogli la sua infedeltà e spiegandogli che ormai un suo bacio gli sarebbe fatale. Accettando il suo destino, il principe le chiede di baciarlo e di dargli la pace eterna. Lei lo bacia, e il principe muore tra le sue braccia. Rusalka chiede il perdono per la sua anima e svanisce nelle acque.
