Eine Wiese an einem Seeufer, in Märchenzeiten. Die Wassernymphe Rusalka sitzt traurig am Ufer, während die Waldnymphen singen und tanzen. Als der Wassermann Vodník sie fragt, warum sie unglücklich sei, erzählt sie ihm, dass sie sich in einen Menschen verliebt hat – den Prinzen – als er zum See kam, um zu schwimmen. Jetzt möchte sie gern selbst ein Mensch werden und auf dem Land bei ihm leben. Schockiert erzählt ihr Vodník, dass die Menschen böse und sündhaft seien. Als Rusalka darauf beharrt, dass sie voller Liebe seien, rät er ihr, dass sie bei der Hexe Ježibaba Hilfe suchen müsse, und lässt sich verzweifelt zurück in den See sinken. Rusalka ruft den Mond an, dem Prinzen von ihrer Liebe zu erzählen. Ježibaba kommt hinzu und erklärt sich bereit, Rusalka in einen Menschen zu verwandeln – mit der Warnung, dass sie, falls sie keine Liebe finde, verdammt sei und der von ihr geliebte Mann sterben müsse. Außerdem werde sie durch ihre Verwandlung in einen Menschen ihre Sprache verlieren. Rusalka, die überzeugt ist, dass ihre Gefühle für den Prinzen alle Zaubersprüche überwinden können, stimmt zu, und Ježibaba gibt ihr einen Zaubertrank. Bei Tagesanbruch erscheint der Prinz mit einer Jagdgesellschaft und findet Rusalka am See. Obwohl sie nicht mit ihm spricht, ist er von ihrer Schönheit eingenommen und führt sie zu seinem Schloss. Vom See hört man die Stimmen von Vodník und den anderen Wassernymphen, die den Verlust Rusalkas beklagen.
Im Schloss des Prinzen besprechen der Wildhüter und der Küchenjunge die bevorstehende Hochzeit des Prinzen mit seiner merkwürdigen jungen Braut, deren Namen niemand kennt. Der Prinz kommt mit Rusalka hinzu. Er fragt sich, warum sie ihm gegenüber so kühl ist, bleibt aber entschlossen, sie zu gewinnen. Eine fremde Fürstin, die zur Hochzeit angereist ist, macht sich über Rusalkas Sprachlosigkeit lustig und wirft dem Prinzen vor, seine Gäste zu ignorieren. Der Prinz schickt Rusalka fort, um sich für den Ball umzuziehen, und begleitet die Fürstin ins Schloss, wo die Festivitäten beginnen. Im verlassenen Garten taucht Vodník aus dem Teich empor. Rusalka, die von ihrer Umgebung zunehmend eingeschüchtert ist, stürzt weinend aus dem Schloss. Sie erlangt plötzlich ihre Stimme wieder und fleht Vodník an, ihr zu helfen, da der Prinz sie nicht mehr liebe. Der Prinz und die Fürstin kommen in den Garten, und der Prinz gesteht ihr seine Liebe. Als Rusalka dazwischenfährt und sich in seine Arme wirft, weist er sie zurück. Vodník warnt den Prinzen vor dem Schicksal, das ihm bevorsteht, und verschwindet mit Rusalka im Wasser. Der Prinz bittet die Fürstin um Hilfe, aber sie lacht ihn aus und sagt ihm, er solle mit seiner Braut zur Hölle fahren.
Rusalka sitzt wieder einmal am See und beklagt ihr Schicksal. Ježibaba erscheint und macht sich über sie lustig, dann gibt sie Rusalka ein Messer und erklärt ihr, es gebe eine Rettung für sie: Sie muss den Prinzen töten. Rusalka weigert sich und wirft die Waffe ins Wasser. Als ihre Schwestern sie ebenfalls zurückweisen, lässt sie sich verzweifelt ins Wasser sinken. Der Waldhüter und der Küchenjunge kommen, um Ježibaba um Hilfe zu bitten. Sie erzählen, dass der Prinz von einem merkwürdigen Waldmädchen verzaubert worden sei, die er habe heiraten wollen. Wutentbrannt taucht Vodník aus dem Wasser auf und entgegnet, es sei der Prinz, der Rusalka getäuscht habe. Die zwei Menschen laufen aus Angst vor der übernatürlichen Gestalt fort. Die Waldnymphen kommen singend und tanzend herbei, aber als Vodník ihnen erklärt, was Rusalka zugestoßen ist, verstummen sie und verschwinden. Der Prinz, der verzweifelt und vor Reue halb wahnsinnig ist, tritt aus dem Wald, sucht nach Rusalka und ruft nach ihr, sie solle zu ihm zurückkehren. Sie erscheint aus dem Wasser, macht ihm Vorwürfe wegen seiner Untreue, und erklärt ihm, dass ihn ein Kuss von ihr nunmehr töten würde. Er akzeptiert dies als sein Schicksal und bittet sie, ihn zu küssen und ihm damit Frieden zu geben. Sie küsst ihn, und er stirbt in ihren Armen. Rusalka bittet um Gnade für seine Seele und verschwindet wieder im Wasser.
