A l’époque des contes de fées, un pré au bord d’un lac. La nymphe Roussalka (Ondine) est assise tristement au bord de l’eau alors que les nymphes des bois chantent et dansent. Lorsque Vodnik, l’Esprit des eaux, lui demande pourquoi elle est si malheureuse, elle lui explique qu’elle est tombée amoureuse d’un être humain – le prince- lorsque celui-ci est venu se baigner dans le lac. Elle veut à présent devenir elle-même humaine et vivre sur terre avec lui. Epouvanté, Vodnik la met en garde : les humains sont des êtres méchants et remplis de pêchés. Mais lorsque Roussalka insiste, déclarant au contraire qu’ils sont pétris d’amour, Vodnik lui répond qu’il lui faudra chercher de l’aide auprès de la sorcière Jezibaba, avant de redescendre dans les profondeurs, désespéré. Roussalka invoque la lune pour qu’elle dise au prince combien elle l’aime. Jezibaba fait son apparition et accepte de transformer Roussalka en être humain tout en l’avertissant que si elle ne trouve pas l’amour, elle finira en enfer et l’homme qu’elle aime mourra. En outre, en devenant humaine, elle perdra l’usage de la parole. Convaincue que ses sentiments vis-à-vis du prince parleront plus fort que tous les sortilèges du monde, Roussalka accepte et Jezibaba lui donne à boire une potion. Alors que l’aube se lève, le prince apparaît, accompagné de chasseurs et trouve Roussalka au bord du lac. Quoiqu’elle ne puisse lui adresser la parole, il est envoûté par sa beauté et la conduit dans son château. Depuis le lac, on entend les voix de Vodnik et des autres Dryades, qui pleurent le départ de Roussalka.
Au château du prince, le garde-chasse et le cuistot commentent l’approche du mariage du prince avec son étrange créature de femme dont personne ne connaît le nom. Le prince fait alors son entrée avec Roussalka. Il se demande pourquoi elle reste si froide à son égard mais reste décidé à conquérir son cœur. Une princesse étrangère, invitée au mariage, se moque de cette Roussalka muette et reproche au prince de ne pas s’occuper de ses invités. Le prince invite Roussalka à aller se préparer pour le bal tandis qu’il escorte la princesse au château pour le début des festivités. Dans le jardin déserté, Vodnik apparaît des profondeurs du bassin. Roussalka qui est devenue de plus en plus intimidée par ce qui l’entoure, s’est échappée du château, en larmes. Retrouvant tout à coup l’usage de sa voix, elle implore Vodnik de l’aider allant même jusqu’à lui dire que le prince ne l’aime plus. Le prince et la princesse rejoignent le jardin et le prince lui avoue son amour. Lorsque Roussalka fait irruption et se jette dans les bras du prince, celui-ci la repousse. Vodnik l’avertit du destin qui l’attend avant de rejoindre les profondeurs en compagnie de Roussalka. Le prince demande à la princesse de l’aider mais celle-ci se met à éclater de rire et lui conseille de suivre son épouse en enfer.
Roussalka est de nouveau assise près du lac, se lamentant sur son sort. Jezibaba surgit et se moque d’elle avant de lui tendre un couteau et lui expliquer qu’il y a encore moyen de trouver son salut : elle doit tuer le prince. Roussalka refuse, jetant l’arme à l’eau. Lorsque ses sœurs la rejettent à leur tour, elle plonge dans les profondeurs du lac, désespérée. Le garde-chasse et le cuistot arrivent pour demander de l’aide à Jezibaba. Le prince, disent-ils, est sous l’emprise d’une étrange fille venue des bois qu’il était sur le point d’épouser. Furieux, Vodnik surgit de l’eau, déclarant que c’est le prince qui a trahi Roussalka. Terrifiés par cette apparition surnaturelle, les deux hommes s’enfuient. Les nymphes des bois entrent alors en chantant et dansant mais lorsque Vodnik leur explique ce qui est arrivé à Roussalka, elles deviennent silencieuses et disparaissent. Désespéré et à moitié fou de remords, le prince émerge de la forêt à la recherche de Roussalka et l’appelle dans l’espoir qu’elle reviendra vers lui. Elle apparaît au-dessus de l’eau, lui reprochant son infidélité et expliquant que désormais, un baiser d’elle lui serait fatal. Acceptant son destin, et dans l’espoir de retrouver une paix intérieure, il demande à Roussalka de l’embrasser. Elle accepte et il meurt dans ses bras. Roussalka implore la miséricorde pour l’âme du prince avant de disparaître dans les profondeurs.
