Antonín Dvořák nacque vicino a Praga (nel Regno di Boemia, parte dell'Impero austriaco, ora Repubblica Ceca), la città dove trascorse la maggior parte della sua vita. Il padre gestiva una macelleria e una locanda ed era anche un suonatore di zither, uno strumento a corda molto diffuso nelle regioni dell'impero d'Austria. Il precoce talento mostrato dal figlio al violino fece sì che questi seguisse prima un corso di studi formali nella piccola località di Zlonice e poi – dal 1857 – altri studi di carattere prevalentemente musicale alla Scuola per Organo di Praga. Dopo essersi diplomato, Dvořák cominciò a guadagnarsi da vivere lavorando come esecutore (al violino e alla viola) e impartendo lezioni di musica. Durante gli anni sessanta ricoprì il ruolo di viola principale nell'Orchestra del Teatro Provvisorio Boemo che, a partire dal 1866, fu spesso sotto la direzione del compositore ceco Bedřich Smetana. Dvořák compose in questo periodo (1865) due delle sue prime composizioni di rilievo, la Prima Sinfonia in Do minore B9 e Cipressi, un ciclo di canzoni per voce e pianoforte, probabilmente ispirato dall'angoscia per l'amore non corrisposto nei confronti di una giovane allieva, l'attrice Josefina Čermáková; tuttavia, qualche anno più tardi (1873), il musicista sposò Anna Čermáková, sorella minore di Josefina.

Altre composizioni di questi anni sono il Quartetto n. 4 in mi minore B19 (1869-70), l'opera Alfred (1870), la cantata Hymnus (1873) e la Terza Sinfonia in mi bemolle maggiore op.10 B34 (1873), opere ancora sotto l'influenza della musica di Richard Wagner. Grazie alla Terza Sinfonia, anche per l'interessamento di Johannes Brahms e del famoso critico musicale Eduard Hanslick, entrambi allora residenti a Vienna, Dvořák ottenne nel 1875 una borsa di studio statale. Lo stipendio annuale permise al musicista ceco di abbandonare i ranghi dell'orchestra e di avere più tempo da dedicare alla composizione.

Negli anni della maturità il linguaggio musicale di Dvořák incominciò a risentire dell'influenza del classicismo di Brahms – ritenuto all'epoca il campione dello schieramento "conservatore", contrapposto a Wagner il "progressista" – e ad assumere come segno distintivo la presenza di ritmi e melodie desunti dalla musica popolare ceca. Fra Brahms e Dvořák si stabilì un rapporto di stima reciproca e amicizia e il compositore tedesco segnalò la musica dell'amico all'editore musicale di Bonn Fritz Simrock, per il quale Dvořák compose la prima delle due serie di Danze Slave (1878), entrambe modellate sulle Danze ungheresi di Brahms. In questo modo la musica di Dvořák cominciò a divenire popolare, circolando con maggiore facilità in Europa.

Nel 1884 Dvořák si recò per la prima volta in Inghilterra, dove diresse con grande successo il suo Stabat Mater op. 58; inoltre compose numerosi lavori per le società corali di Birmingham e Leeds, fra cui la cantata The Spectre's Bride op. 69 B135 (1885, La Sposa dello Spettro), l'oratorio Santa Ludmilla op. 71 (1886) e il Requiem op. 89 (1891). Fra gli altri lavori destinati al pubblico britannico ci sono anche la Settima Sinfonia in Re minore Op. 70 B141 (1885) e l'Ottava Sinfonia in Sol maggiore op. 88 B163 (1888), commissionate dalla Royal Philharmonic Society.

Su invito di Jeannette Thurber, una ricca esponente dell'alta società, Dvořák si trasferì a New York, dove dal 1892 al 1895 assunse la direzione del Conservatorio Nazionale. 

Durante l'inverno e la primavera del 1893, mentre era a New York, Dvořák scrisse la sua opera più celebre, la Sinfonia n. 9 detta Dal nuovo mondo. A seguito di un invito della sua famiglia, trascorse l'estate del 1893 nella comunità di lingua ceca a Spillville, Iowa. Lì compose due delle opere da camera più famose, il Quartetto per archi in fa maggiore op. 96 (detto Americano) e il Quintetto d'archi in mi bemolle maggiore op. 97.

Negli Stati Uniti anche scrivere anch'egli un concerto per violoncello, il Concerto per violoncello in Si minore (1895). Da allora il concerto, considerato uno dei migliori del suo genere, è cresciuto in popolarità e oggi è frequentemente eseguito. Dvořák aveva lasciato incompiuta un'analoga composizione, il Concerto per violoncello e orchestra in la maggiore (1865), che fu completata e orchestrata dal compositore tedesco Günter Raphael tra il 1925 e il 1929 e da Jarmil Burghauser nel 1952.

Altro luogo importante per il percorso artistico del compositore fu Lužany. L'architetto e mecenate Josef Hlavka (1831–1908) risiedeva nel castello, che aveva ricostruito insieme con il parco nel 1886-1887. La seconda moglie di Hlavka, Zdenka Hlavková (1843–1902), era pianista e cantante e portò a Lužany un grande numero di artisti, pittori, scultori, scrittori e musicisti, tra i quali Dvořák, che compose qui l'opera Il Diavolo e Caterina (1898-1899). Per la consacrazione della nuova cappella del castello, Dvořák compose su commissione di Hlavka la Messa in re maggiore per soli, coro e orchestra op. 86, che fu eseguita l'11 settembre 1887 con la direzione del compositore stesso e la Hlavková tra i solisti. A Lužany venne data in forma privata la prima esecuzione del Concerto per violoncello n. 2 nell'agosto 1895.

Tornò, infine, a Praga, dove fu direttore del Conservatorio dal 1901 fino alla morte, nel 1904.

È sepolto nel cimitero di Vyšehrad a Praga.