Gabriel von Eisenstein muss eine Arreststrafe wegen Beleidigung einer Amtsperson antreten. Da befolgt er gerne den Rat seines Freundes Dr. Falke, sich in der Nacht noch beim Prinzen Orlofsky zu amüsieren. In Wirklichkeit hat Dr. Falke vor, sich für einen früheren Streich Eisensteins zu revanchiere. Rosalinde von Eisenstein lässt ihren Gemahl gern ziehen, als der vermeintlich ins Gefängnis aufbricht. Auch dem Kammermädchen Adele, das vorgibt, eine kranke Tante besuchen zu wollen, gibt sie frei. Als alle weg sind, kommt Alfred, um sich mit Rosalinde zu vergnügen. Leider wird das Techtelmechtel vom Gefängnisdirektor Frank gestört, der Eisenstein abholen will: Da bleibt Alfred aus Rücksicht auf Rosalinde nichts übrig, als deren Gemahl zu spielen und sich ins Gefängnis abführen zu lassen.
Im Gartensalon bei dem jungen Prinzen Orlofsky verspricht Dr. Falke dem Prinzen, dass er heute noch viel zu lachen haben werde. Eisenstein tritt als „Marquis Renard“ bei ihm auf, Adele wird als die junge Künstlerin Olga vorgestellt. Eisensteins Verdacht, sie sei sein Stubenmädel, weist sie zurück. Gefängnisdirektor Frank wird als „Chevalier Chagrin“ in die Gesellschaft eingeführt, und selbst die als ungarische Gräfin verkleidete Rosalinde erscheint – Dr. Falke hat sie kommen lassen mit dem Hinweis, ihr Ehemann sei dort. Es gelingt ihr, dem von ihr faszinierten Eisenstein (der sie nicht erkennt) seine Taschenuhr zu entwenden, die sie benötigt, um ihrem Gemahl (den sie natürlich erkannt hat) später seine Untreue zu beweisen.
Vom Champagner angeheitert, erzählt Eisenstein vor allen Gästen, wie er einst Dr. Falke blamierte, als er ihn in seinem Fledermauskostüm (sie waren auf einem Maskenball) dem Spott der Marktfrauen und Gassenbuben aussetzte.
In der Morgenfrühe will der schwer bezechte Frank seinen Dienst als Gefängnisdirektor antreten. Der noch schwerer betrunkene Zellenschließer Frosch soll berichten, was inzwischen vorgefallen ist, und nutzt diesen Bericht zu einer mehr oder minder improvisierten Persiflage aktueller örtlicher Ereignisse. Da zeigt sich, dass Adele (mit ihrer Schwester Ida) Frank gefolgt ist. Adele gibt zu, wer sie wirklich ist, und bittet den vermeintlichen Chevalier, sie für die Bühne ausbilden zu lassen. Jetzt erscheint auch Eisenstein, der seine Strafe antreten will und nun von Frosch erfährt, dass er, Eisenstein, doch schon gestern eingeliefert worden sei. Es stellt sich aber heraus, dass sein Doppelgänger kein anderer ist als Alfred; und als auch noch Rosalinde auftaucht, durchschaut Eisenstein das Verhältnis zwischen Alfred und seiner Frau, wird jedoch kleinlaut, als Rosalinde ihm die Uhr vorweist, die sie ihm in Gestalt der „ungarischen Gräfin“ bei Orlofskys Fest abgenommen hat.
Schließlich trifft die ganze Festgesellschaft mit Prinz Orlofsky und Dr. Falke ein. Jetzt wird klar: Die gesamte Inszenierung war die gelungene „Rache der Fledermaus“ Falke. Der köstlich amüsierte Prinz verspricht Adele, sie als Mäzen zu fördern.
