Enrico VIII è ormai stanco di Anna Bolena, la sua seconda moglie, e vorrebbe liberarsene con un pretesto per poter sposare Giovanna di Seymour. Anna, ancora ignara del suo destino, avverte attorno a sé silenzio e imbarazzo e cerca conforto proprio in Giovanna, che a sua volta, intuendo i disegni del re, è assalita dal rimorso e teme per la regina. Una canzone intonata da Smeton, paggio e musico della regina e di lei innamorato, commuove Anna che ripensa con nostalgia a Lord Riccardo Percy, il suo primo amore. 

Intanto Giovanna si incontra con re Enrico, dal quale apprende che egli desidera farla sua sposa e regina. Ai dinieghi e al crescente turbamento di Giovanna, il re replica rivelando di essere a conoscenza di un amore giovanile di Anna. Giovanna si augura che ciò non sia preludio a qualche tragico evento. Nel parco del castello, Rochefort, fratello di Anna, si è nel frattempo imbattuto proprio in Percy, graziato dal re e appena ritornato dall’esilio. Il giovane, che non ha mai dimenticato Anna, è tornato solo per rivederla. Sopraggiunge il re con Anna. Percy apprende così di essere stato graziato per intercessione della stessa regina. La reazione dei due antichi amanti, che nel rivedersi restano turbati, suscita il crudele divertimento del re, che finge grande benevolenza sperando in un pretesto per sbarazzarsi di Anna. Intanto, nell’appartamento di Anna, Smeton contempla con amore un ritratto della regina, che ha segretamente sottratto e che ora sta per riporre: al sopraggiungere di questa e di Rochefort si nasconde. Dopo un colloquio con il fratello, Anna rimane sola e si pente di avere ceduto al desiderio di rivedere il suo antico amore. Sopraggiunge Percy che, intuendo l’infelicità di Anna e l’odio di Enrico per lei, le chiede apertamente di cedere ai sentimenti di un tempo. Quando Anna rifiuta e lo supplica di partire, Percy, disperato, sguaina la spada per uccidersi. Smeton, che ha assistito al segreto colloquio e che crede minacciata la regina, interviene. Sopraggiunge il re, che davanti ai cortigiani e alle dame accusa Anna di adulterio; nell’ansia di scagionare la regina, Smeton ne lascia cadere il ritratto. Di fronte a una prova che a tutti appare inconfutabile, Enrico ordina l’arresto di Anna, Percy, Rochefort e Smeton.

Mentre in carcere, Anna affronta il dolore dell’ingiustizia subita, Seymour è in preda all’angoscia e al rimorso. Si incontra in segreto con la regina per consolarla e tentare di salvarla: se ammetterà il tradimento sarà graziata. Di fronte allo sdegnato rifiuto della regina, Giovanna rivela incautamente che il re ama un’altra donna. Anna si adira e Giovanna si smarrisce sempre più fino a svelare tra le lacrime di essere la nuova favorita del re. Commossa da tanto strazio, la regina perdona e consola la rivale. Intanto, convinto di salvare così la vita di Anna, il giovane Smeton si accusa di esserne stato l’amante offrendo finalmente a Enrico il pretesto per una condanna. In un drammatico confronto, Percy rivela al re che Anna è stata sua sposa e reclama i suoi diritti, ricusando qualsiasi pretesa accusa di tradimento da parte del re. Enrico comprende che Percy tenta di far cadere così l’accusa di adulterio nei confronti di Anna e affida il loro giudizio al Consiglio dei Pari. Mentre si attende il verdetto, Giovanna incontra il re e lo scongiura di graziare Anna poiché il rimorso la spingerebbe a lasciarlo, nonostante lo ami; Enrico, tuttavia, appreso che il Consiglio dei Pari ha ratificato la condanna di Anna, non si pronuncia e congeda Giovanna. Intanto nelle prigioni della Torre di Londra, Hervey, ufficiale del re, comunica a Percy e a Rochefort che Enrico intende graziarli ma che persegue nel proposito di riservare la pena capitale alla regina. Indignati, i due nobili scelgono entrambi di seguire Anna al supplizio. Mentre si odono i cannoni che festeggiano le nozze tra Enrico e Giovanna di Seymour, Anna alterna momenti di lucidità e di delirio; rivive il matrimonio con il re, l’amore giovanile per Percy e si strugge per la morte degli innocenti. Poi, invocando sulla coppia regale il perdono divino, muore.