Der Hof wartet in Schloss Windsor auf den König, der wieder einer neuen Dame sein Herz zugewendet hat. Diese ist Jane Seymour, eine Hofdame der Königin. Der König verspricht ihr die Heirat und will die Ehe mit Anne Boleyn lösen.
Im Park des Schlosses trifft Lord Rochefort Annes ehemaligen Geliebten, Lord Richard Percy. Dieser wurde nach Annes Heirat verbannt, konnte aber jetzt, nachdem die Königin seine Begnadigung durchgesetzt hat, zurückkehren. In Gegenwart des Königs bezeugt Percy der verlegenen Anne seine ewige Dankbarkeit.
Auch der Page Smeton liebt die Königin. Er hat ihr Medaillon entwendet und will es gerade zurückbringen, als Percy und Rochefort zurückkommen. Während sich Smeton schnell versteckt, hört er, wie Rochefort Anne überredet, Percy noch einmal zu empfangen. Dieser gesteht Anne seine Liebe, wird aber entschieden abgewiesen und will sich daraufhin erdolchen. Smeton stürzt herbei, um den Selbstmord zu verhindern, doch Percy wirft sich auf ihn.
In diesem Augenblick erscheint der König mit seinem Gefolge. Die Situation ist so kompromittierend, dass niemand Percys und Smetons Unschuldsbeteuerungen glaubt, zumal Smeton noch das Medaillon entfällt. Froh über den Vorwand, lässt der König Rochefort, Percy, Smeton und die Königin verhaften und nach London vor Gericht bringen.
Jane sucht die Königin auf und rät ihr, sich schuldig zu bekennen. Wenn sie dadurch dem König die Möglichkeit zu einer neuen Ehe gäbe, könne sie sich retten. Anna aber weigert sich - selbst als sie erfährt, dass ihre Hofdame die neue Favoritin des Königs ist.
Hervey berichtet der Hofgesellschaft, dass Smeton ein Geständnis abgelegt hat; allerdings weiss niemand, dass es durch Folter erpresst wurde. Als Anne und Percy vor den König gebracht werden, fordert Percy seine älteren Rechte auf die Hand der Königin, da sie schon vor ihrer Heirat mit dem Herrscher ihm angetraut war. Der König triumphiert, Anne wird von den Pairs wegen Ehebruchs zum Tode verurteilt. Vergebens bittet Jane um Gnade.
Auch Percy und Rochefort sind verurteilt worden. Sie lehnen eine Begnadigung ab, als sie hören, dass Anne sterben muss. Diese fällt in geistige Umnachtung, die sich erst wieder löst, als Percy, Rochefort und Smeton, der seine erzwungene Falschaussage bereut, vor sie gebracht werden. Anne wird zum Tode geführt und verzeiht allen, wie auch der Himmel ihr vergeben möge.
