Remplis d'angoisse et de terreur, les Hébreux supplient le Seigneur de leur venir en aide face aux troupes babyloniennes. Le grand prêtre Zaccaria a pris en otage Fenena, fille de Nabucco, roi de Babylone. Il exhorte son peuple à espérer en l'aide divine : Fenena pourrait constituer un gage de paix entre les Hébreux et les Babyloniens. Ismaël, neveu du roi des Hébreux, annonce que l'avance de Nabucco et de ses soldats ne connaît désormais plus de frein. Zaccaria incite les Hébreux à repousser l'ennemi et, après avoir confié Fenena à Ismaël, s'éloigne avec tous les Hébreux pour défendre la ville et le temple. Ismaël et Fenena, secrètement amoureux l'un de l'autre, sont restés seuls. Il lui rappelle comment elle l'avait fait évader de prison à Babylone lorsqu'il s'y était rendu comme ambassadeur. Maintenant, c'est lui qui est résolu à la libérer à son tour et à fuir avec elle. Les deux jeunes gens sont en train d’organiser leur fuite quand pénètre dans le temple Abigaïlle, fille de Nabucco, à la tête d'une troupe de Babyloniens déguisés en Hébreux. Aussi amoureuse d’Ismaël, Abigaïlle est prête à sauver le peuple hébreu si Ismaël la préfère à Fenena, mais n'obtient pas ce qu'elle veut. Nabucco, à la tête de son armée, ayant osé faire irruption dans le temple et décidé à piller la ville, Zaccaria menace de tuer Fenena. Alors que le grand prêtre est sur le point de porter à Fenena un coup mortel, Ismaël s'interpose, retient la main de Zaccaria et délivre Fenena. Nabucco donne alors l'ordre de piller le temple et d'emprisonner les Hébreux. Zaccaria et les Hébreux maudissent Ismaël qui, en délivrant Fenena, a trahi la patrie.
Seule dans les appartements royaux, Abigaïlle tient dans ses mains un parchemin volé à Nabucco, et qui témoigne de ses origines humbles d'esclave. Sa colère éclate dans une fureur irrépressible à la nouvelle que Fenena, nommée régente par son père, a ordonné de libérer tous les Hébreux. Maintenant, Abigaïlle est déterminée à tout faire pour s'emparer du trône. Zaccaria, prisonnier des Assyriens, entre dans une salle du palais, suivi d'un Lévite portant les Tables de la Loi, et se retire après avoir demandé à Dieu de parler à travers ses lèvres. Ismaël, convoqué par le grand prêtre pour répondre de sa trahison, est maudit par les Lévites, mais Anna, la sœur de Zaccaria, le défend : le jeune homme n’a en effet pas sauvé la vie d'une infidèle, mais celle d’une Juive, puisque la fille du roi ennemi s'est convertie depuis à la religion hébraïque. La situation a empiré : en une succession rapide d'événements, Abigaïlle fait irruption sur la scène avec son entourage et demande à Fenena la couronne, mais Nabucco, que l’on croyait mort dans la bataille, arrive et se saisit de la couronne. Puis il commence à se moquer du Dieu Belos, qui a poussé les Babyloniens à le trahir, puis du Dieu des Hébreux. À la suite de la déclaration de Fenena qui divulgue sa propre conversion, il lui demande de façon imposante de s’agenouiller et de l’adorer, non pas comme un roi, mais comme un Dieu, un Dieu unique, et menace de mort Zaccaria et les Hébreux s’ils ne se plient pas à sa volonté. Immédiatement après, le Dieu des Hébreux lui lance un éclair à la tête, la couronne tombe au sol, et le roi commence à montrer des signes d'aliénation mentale. La couronne tant convoitée est rapidement recueillie par Abigaïlle.
Abigaïlle, assise sur le trône à côté de la statue d'or de Belos, dans les jardins suspendus de Babylone, reçoit l'hommage de ses sujets. Quand le grand prêtre lui remet la condamnation à mort des Hébreux, la reine feint de ne pas être certaine du sort à leur réserver. À l'arrivée du roi déchu, vêtu d'humbles vêtements et l'air égaré, l'usurpatrice change d'attitude et s'adresse à lui avec une arrogance ironique et donne l'ordre de le reconduire dans ses appartements. Elle le prévient qu'elle est désormais la gardienne de son siège et l'invite péremptoirement à apposer le sceau royal sur la sentence de mort des Hébreux. Le vieux roi hésite, Abigaïlle le menace, l'accusant de lâcheté, et à la fin Nabucco cède. Mais il est pris d'un doute : qu'en sera-t-il de Fenena ? Abigaïlle, implacable, lui affirme que personne ne pourra sauver sa fille et lui rappelle qu'elle aussi est sa fille. Mais le roi lui révèle qu'elle est seulement une esclave. Elle tire de son sein le parchemin qui atteste son origine et le réduit en lambeaux. Le roi, trahi et détrôné, en entendant le son des trompes qui annoncent l'imminence du supplice des Hébreux, appelle ses gardes, mais ceux-ci viennent l'arrêter, obéissant aux ordres de la nouvelle reine. Déconcerté et impuissant, Nabucco demande en vain à Abigaïlle un geste de pardon et de pitié pour la pauvre Fenena.
Sur les bords de l'Euphrate, les Hébreux, vaincus et prisonniers, se rappellent avec nostalgie et douleur leur chère patrie perdue. Le grand prêtre Zaccaria les incite à ne pas pleurer comme des femmes et prophétise une sévère punition pour leur ennemi : le Lion de Juda vaincra les Assyriens et détruira Babylone.
Seul dans une salle du palais, Nabucco se réveille d'un cauchemar en entendant des cris et, les prenant pour des appels à la guerre, rassemble ses preux pour marcher sur Jérusalem. Entendant en lui d'autres voix qui répètent le nom de Fenena, il s'avance à la fenêtre et voit avec horreur sa fille enchaînée. Désespéré, il court à la porte, tente en vain de l'ouvrir et, se rendant enfin compte qu'il est prisonnier, s'adresse au Dieu de Juda pour invoquer son aide et implorer son pardon. Comme en réponse à sa prière surgit son fidèle officier Abdallo avec une poignée de soldats. Abdallo lui restitue son épée et lui offre de l'aider à reconquérir son trône.
Dans les jardins suspendus de Babylone passe le triste cortège des Hébreux conduits au supplice. Zaccaria rassure Fenena en l'incitant à conquérir la palme du martyre ; la jeune fille se prépare à jouir de la joie céleste. L'atmosphère mystique est troublée par l'arrivée de Nabucco qui, à la tête de ses troupes, ordonne de briser la statue de Belos. « Miraculeusement », l'idole tombe d'elle-même. Tous crient au « divin prodige », Nabucco redonne la liberté aux Hébreux, annonce que la perfide Abigaïlle s'est empoisonnée et ordonne aux Hébreux de construire un temple pour leur dieu grand et fort, seul digne d'être adoré. Pendant que tous, Hébreux et Assyriens, s'agenouillent et invoquent l'« immense Jéhovah », entre Abigaïlle soutenue par deux guerriers : elle confesse sa faute et implore le pardon des hommes et de Dieu avant de tomber inanimée. Zaccaria adresse à Nabucco la dernière prophétie : « En servant Jéhovah, tu seras le roi des rois !».
