Die Hebräer samt den Leviten sind in Salomons Tempel versammelt, um das Schicksal der Israeliten zu beklagen, die vor kurzem von dem babylonischen König Nabucco besiegt wurden. Dieser marschiert gerade in die Stadt ein. Der Hohepriester Zaccaria ermutigt seine Gefolgsleute, die Hoffnung nicht aufzugeben, da sie in Nabuccos Tochter Fenena eine wertvolle Geisel besitzen. Fenena wird durch Ismaele bewacht, den Neffen des Königs Sedecia von Jerusalem. Ismaele ist in Fenena verliebt, die ihn unter großem persönlichem Risiko befreit hatte, als er Gefangener in Babylon war. Diese Gunst möchte er nun zurückgeben. Die zwei planen fortzulaufen, als Abigaille, von der jeder glaubt, sie sei Nabuccos erstgeborene Tochter, an der Spitze von als Hebräer verkleideten babylonischen Soldaten den Tempel betritt. Abigaille offenbart Ismaele ihre Liebe und bietet an, alle Hebräer freizulassen, wenn er ihre Liebe erwidert. Ismaele will sich nicht erpressen lassen. Währenddessen begehren Hebräer, die von Nabuccos Soldaten gejagt wurden, Zuflucht im Tempel. Nabucco erscheint. Zaccaria droht, Fenena zu töten, wenn Nabucco und seine Leute es wagen, den heiligen Platz zu missachten. Er hebt den Dolch, aber Ismaele schreitet ein und rettet sie vor dem Tod. Zaccaria verdammt den Verräter. Nabucco umarmt seine Tochter und befiehlt, den Tempel niederzubrennen.
Aus einem von Nabucco geheimgehaltenen Dokument erfährt Abigaille ihre wahre Herkunft. Sie ist nicht Nabuccos Erstgeborene, sondern die Tochter einer Sklavin.
Sie ist entschlossen, sich an Fenena zu rächen, der Nabucco den Thron anvertraut hat, während er die Hebräer bekämpft. Sie will ihre Rivalin töten, den Thron übernehmen und die Nachricht verbreiten, dass Fenena tot sei. Ihr Vorhaben wird durch den Hohepriester des Baal unterstützt.
In einem anderen Flügel des Palastes Zaccaria ist frei. Er und seine Leute bekehren Babylonier, die zum jüdischen Glauben konvertieren. Der Chor der Leviten verwünscht Ismaele, da er Fenena das Leben gerettet hat. Sie verachten ihn wegen seines Verrates (Fluchtmöglichkeit für Fenena). Zaccaria gebietet dem Chor Einhalt – Ismaele sei kein Verräter, da er das Leben einer Konvertierten gerettet hat.
Abigaille ist dabei, ihren Plan auszuführen, die Macht an sich zu reißen, als Nabucco zurückkehrt. Er ergreift die Krone und erklärt sich selbst zum Gott, den die Leute bis in alle Ewigkeit anbeten sollen. Blitze schlagen neben dem König ein, er verliert den Verstand. Abigaille setzt sich die Krone auf.
Abigaille, die sich selbst zur Königin ernannt hat, sitzt auf dem Thron im Beisein des Hohepriesters des Baal, um die Huldigung der Adligen zu empfangen. Der wahnsinnig gewordene Nabucco erscheint. Abigaille bringt ihn mit List dazu, das Dokument zu unterschreiben, mit dem das Todesurteil der Hebräer, inklusive der konvertierten Fenena, vollstreckt werden kann.
Nabucco begreift dies zu spät, protestiert und droht Abigaille, die Details ihrer Geburt offenzulegen. Er sucht nach dem Dokument über ihre Herkunft, aber Abigaille hat es schon und zerreißt es. Sie übergibt den alten König den Wachen und lässt ihn einsperren. Nabucco bittet sie um Verzeihung und verspricht, den Thron abzutreten, wenn Abigaille Fenena verschont. Abigaille lehnt den Vorschlag ab.
Die Hebräer, zur harten Arbeit verdammt, beklagen ihr schönes und verlorenes Heimatland und rufen den Herrn um Hilfe.
Zaccaria ermutigt sein Volk mit der Prophezeiung von der Heimsuchung und dem Untergang Babylons.
Nabucco, der aus einem tiefen Schlaf voller Alpträume erwacht, hört Fenenas Namen von der Straße; die Gefangenen und Fenena werden zur Hinrichtung geführt. In diesem Moment väterlicher Angst verlässt ihn der Wahnsinn. Nabucco kniet nieder, um den Gott der Hebräer um Erbarmen anzuflehen und ihm Verehrung zuzusagen. Plötzlich öffnet sich das Tor, und eine Gruppe königstreuer Wachen erscheint. Mit gezogenem Schwert folgen sie ihm, um seine Krone zurückzufordern und Fenena zu befreien.
Fenena wurde mit anderen Hebräern zum Opferaltar in den hängenden Gärten gebracht. Der Hohepriester des Baal führt die Opferzeremonie durch, als Nabucco und seine Gefolgsleute eintreten. Er befiehlt, das Götzenbild umzustürzen. Es fällt zu Boden und zersplittert. Die Juden sind befreit, und Nabucco ermahnt seine Leute, sich vor dem Gott der Juden Jehovah zu verneigen. Die besiegte Abigaille vergiftet sich. Sterbend bittet sie den Gott der Hebräer um Vergebung. Nabucco preist zusammen mit dem Volk Israels Jehovah und die wiedergewonnene Freiheit.
