Nel Tempio di Gerusalemme, i Leviti e il popolo lamentano la triste sorte degli Ebrei, assediati dal re di Babilonia Nabucodonosor alle porte della città. Il gran profeta Zaccaria cerca di confortare e incoraggiare la sua gente presentando un prezioso ostaggio, Fenena, figlia di Nabucodonosor, che affida in custodia a Ismaele, nipote del re di Gerusalemme. Ma il giovane è sul punto di tradire il suo popolo volendo liberare la prigioniera e fuggire con lei; in passato, mentre egli stesso si trovava a Babilonia come prigioniero, era stato liberato proprio da Fenena, di lui innamorata. Mentre i due stanno organizzando la fuga, giunge nel tempio un drappello dei Babilonesi travestiti da Ebrei guidato dall'altra figlia del re babilonese, Abigaille. È anch'ella innamorata di Ismaele e minaccia la sorella di riferire al padre il piano di fuga degli innamorati, ma alla fine si dichiara disposta a tacere a patto che Ismaele rinunci a Fenena e risponda al suo amore. A capo del suo esercito irrompe Nabucodonosor, deciso a saccheggiare la città e dunque Zaccaria, per fermarlo, minaccia di uccidere Fenena: Ismaele però la strappa dalle mani del gran sacerdote e la consegna sana e salva nelle mani di Nabucodonosor; ma lui, irato, imprigiona gli Ebrei e fa incendiare il tempio.
Sola negli appartamenti reali, Abigaille tiene fra le mani una pergamena sottratta a Nabucco, che attesta le sue umili origini di schiava. La sua rabbia esplode in una furia incontenibile alla notizia che Fenena, nominata reggente dal padre, ha dato ordine di liberare tutti gli ebrei. Abigaille accetta l'invito del Sacerdote di Belo di impossessarsi della corona.
Intanto, prigioniero degli Assiri in Babilonia con tutto il suo popolo, Zaccaria entra in una sala della reggia seguito da un levita che reca le Tavole della Legge e, dopo aver sollecitato Iddio a parlare attraverso il suo labbro, si reca all'incontro con Fenena che ha deciso di convertirsi al Dio degli Ebrei. Vedendo Ismaele, i Leviti gli intimano di fuggire, maledicendolo perché li ha traditi, ma interviene Anna, sorella di Zaccaria, affermando che il giovane non ha salvato la vita a un'infedele bensì a un'ebrea, giacché la figlia del re nemico Fenena si è nel frattempo convertita alla Legge.
Essendo Nabucco dato per morto in guerra, Abigaille ne approfitta: irrompe in scena con il suo seguito e pretende da Fenena la corona, ma il re babilonese si rivela vivo e giunge a riprenderla, poi comincia a deridere il Dio di Babilonia, che avrebbe spinto i Babilonesi a tradirlo, e il dio degli Ebrei (Yəhōwāh), ed esige di essere adorato come l'unico Dio, minacciando di morte Zaccaria e gli Ebrei se non si piegheranno al suo volere. Subito un fulmine scende sul suo capo, e la corona cade al suolo; Abigaille la recupera e si autoproclama regina a difesa delle sorti dell'Assiria, ma intanto il re comincia a manifestare segni di follia.
Seduta sul trono accanto alla statua d'oro di Belo, nei giardini pensili di Babilonia, Abigaille riceve l'omaggio dei suoi sudditi. Il Gran Sacerdote di Belo le consegna la sentenza di condanna a morte degli Ebrei, e la regina si finge incerta sul da farsi. All'arrivo del re spodestato, con vesti dimesse e con lo sguardo smarrito, l'usurpatrice cambia atteggiamento e gli si rivolge con ironia e arroganza, lo fa ricondurre nelle sue stanze, quindi lo avverte di essere divenuta la custode del suo seggio e lo invita perentoriamente a porre il regale suggello sulla sentenza di morte degli Ebrei. Il vecchio re la accontenta, ma subito vede il nome di Fenena nell'elenco dei condannati; l'implacabile Abigaille afferma che nessuno potrà salvarla in quanto traditrice, e rivendica di essere anch'essa sua figlia. Il re ribadisce la sua vera condizione di schiava, ma la donna, quasi non aspettando altro, trae allora dal seno la pergamena che attesta la sua origine e la fa a pezzi. Ormai tradito e detronizzato, nell'udire il suono delle trombe che annunciano l'imminente supplizio degli Ebrei, il re chiama le sue guardie, ma esse giungono per arrestarlo, obbedendo alla nuova regina. Confuso e impotente, Nabucco chiede invano perdono ad Abigaille e invoca pietà per la povera Fenena.
Sulle sponde dell'Eufrate, gli Ebrei, sconfitti e prigionieri, ricordano con nostalgia e dolore la cara patria perduta, ma il pontefice Zaccaria li incita a non piangere e profetizza una dura punizione per il loro nemico: il Leone di Giuda sconfiggerà gli Assiri e distruggerà Babilonia.
Nabucodonosor si sveglia da un incubo udendo alcune grida e, credendole segnali di guerra, chiama i suoi prodi a raccolta per marciare contro Gerusalemme. Tornato in sé, all'udire altre voci che ripetono il nome di Fenena, egli si affaccia alla loggia e vede con orrore la figlia in catene. Disperato, corre alla porta, tenta invano di aprirla e infine, rendendosi conto di essere prigioniero, cade in ginocchio e si rivolge al Dio di Giuda invocando il suo aiuto e chiedendogli perdono. Come in risposta alla sua preghiera, sopraggiunge il fedele ufficiale Abdallo con un manipolo di soldati, restituendogli la spada e offrendosi di aiutarlo a riconquistare il trono.
Nei giardini pensili di Babilonia passa il triste corteo degli Ebrei condotti al supplizio. Zaccaria conforta Fenena e la fanciulla si prepara a godere delle gioie celesti. L'atmosfera mistica è interrotta dall'arrivo di Nabucco che, alla testa delle sue truppe, ordina di infrangere la statua di Belo. Miracolosamente, «l'idolo cade infranto da sé» e tutti gridano al «divino prodigio». Nabucco concede la libertà agli Ebrei, annunzia che la perfida Abigaille si è avvelenata e ordina al popolo d'Israele di costruire un tempio per il suo Dio grande e forte, il solo degno di essere adorato. Mentre tutti, ebrei e assiri, s'inginocchiano invocando l'«immenso Jehova», entra Abigaille sorretta da due guerrieri: la donna confessa la sua colpa e invoca il perdono degli uomini e di Dio prima di cadere esanime. Zaccaria rivolge a Nabucco l'ultima profezia: «Servendo a Jehova sarai de' regi il re!».
