Au palais de Westminster, les courtisans attendent l'arrivée de la reine Élisabeth dont le mariage doit réunir les couronnes d'Angleterre et de France. En réalité, la reine, bien que consciente des avantages que cette union procurerait à son pays, est attirée par un autre homme que le roi de France et elle confesse son hésitation.
Profitant de l'atmosphère de liesse qui règne, Talbot presse la reine de faire grâce à Marie Stuart, mais son chancelier, Lord Cecil, lui rappelle qu'on ne peut faire confiance à la reine d'Écosse et lui conseille de la faire exécuter. Élisabeth prie le ciel de la guider dans ses actes et menace de se venger de Marie Stuart s'il se confirme que, comme elle le soupçonne, celle-ci est éprise de Leicester, qui est l'homme dont elle est elle-même amoureuse.
Leicester arrive et Élisabeth le nomme ambassadeur auprès du roi de France et lui remet un anneau en lui demandant d'annoncer qu'elle accepte l'offre de mariage tout en se réservant encore la possibilité de changer d'avis. Leicester semble indifférent à cette résolution, ce qui provoque un vif dépit de la reine.
Après le départ de la reine et des courtisans, Talbot avoue à Leicester qu'il s'est rendu auprès de Marie Stuart à Fotheringay et que la reine emprisonnée a demandé l'aide de Leicester et lui remet la lettre qu'elle lui adresse. Leicester est touché par ce message et par la beauté du portrait qu'on lui présente et promet d'aider la prisonnière. Mais Élisabeth revient, demande à voir le billet qu'il tient à la main et réalise que Marie convoite non seulement son trône mais aussi l'homme qu'elle aime. Leicester nie être amoureux de la reine d'Écosse, non sans louer sa beauté en termes passionnés, et, quoique non sans renforcer ses soupçons, convainc Élisabeth d'aller rendre visite à sa cousine à Fotheringay.
Dans le parc de Fotheringay, Marie, en compagnie de sa suivante Anna, évoque les souvenirs heureux de sa vie passée à la cour de France où elle a été élevée. C'est alors qu'arrive l'équipage d'Élisabeth qui chasse à proximité du château. Marie, inquiète à l'idée de se retrouver en présence de sa cousine, s'apprête à quitter le lieu lorsqu'arrive Leicester qui lui conseille de se soumettre tout en jurant de la venger si la reine restait insensible à ses prières. À la fin de leur duo, il demande Marie en mariage.
Marie s'éloigne et Leicester accueille Élisabeth. Celle-ci est mal à l'aise et, voyant Marie que Talbot est allé chercher, elle refuse d'abord de lui. Marie se force à s'agenouiller devant sa cousine et à implorer son pardon. Mais la reine la repousse et, sur un ton sarcastique, l'accuse d'avoir trahi et assassiné son époux, Darnley, puis s'en prend à Leicester qui tente de réconforter Marie. Marie réagit en insultant sa cousine qu'elle traite de « fille impure d'Anne Boleyn » et de « bâtarde ». La reine la condamne à mort.
Au palais de Westminster, Élisabeth n'a pas encore signé la sentence de mort mais la vue de Leicester, qu'elle soupçonne d'être amoureux de sa cousine, et les pressions de Lord Cecil ont raison de son hésitation.
Entre Leicester qui implore sa clémence, mais la reine le repousse froidement et lui donne l'ordre d'assister à l'exécution.
À Fotheringay, Lord Cecil informe Marie de la sentence. Elle refuse les services d'un prêtre anglican et sa confession est reçue par le loyal Talbot dans une scène célèbre, l'un des sommets de l'opéra. Marie croit voir le fantôme de son second mari, Arrigo. Elle rappelle douloureusement le souvenir de Rizzio puis nie toute part au meurtre de son mari qu'elle attribue à la jalousie d'Élisabeth.
Les partisans de Marie s'indignent et Anna tente de les calmer en leur reprochant de troubler les dernières heures de sa maîtresse. Celle-ci prie Dieu de façon à la fois calme et pathétique tandis qu'on entend le premier des trois coups de canon qui annoncent l'exécution capitale. Cecil vient annoncer qu'Élisabeth accorde à Marie une dernière volonté. Marie demande qu'Anna l'accompagne jusqu'au pied de l'échafaud. Leicester, bouleversé, apparaît et le deuxième coup de canon provoque son ultime protestation d'innocence. Au troisième coup, Marie marche, la tête haute, vers la mort.
