Der französische Gesandte wirbt für seinen Souverain bei Königin Elisabeth, die einer solchen Verbindung nicht abgeneigt ist, jedoch, weil sie Leicester liebt, Bedenkzeit erbittet und den Gesandten mit einer entsprechenden Botschaft entlässt. Da Leicester dabei keinerlei Gemütsregungen erkennen lässt, wird Elisabeths Vermutung, dass er die gefangene Maria Stuart liebt, fast zur Gewissheit. Als Leicester von Talbot einen Brief Marias erhält, kann er seine Bestürzung gegenüber der Königin nicht verbergen, die von ihm den Brief verlangt, in dem Maria eine Unterredung mit Elisabeth wünscht. Obwohl Leicester leugnet, Maria zu lieben, und behauptet, nur ihre Schönheit zu bewundern, glaubt ihm die Königin nicht, will aber trotzdem ihre Gegnerin empfangen. 

Leicester ist nach Schloss Fotheringhay, in dem Maria mit ihrer Amme und Vertrauten Anna Kennedy gefangengehalten wird, vorausgeeilt, um sie auf die Begegnung mit Elisabeth vorzubereiten. Marias Jugend und Schönheit machen Elisabeth so wütend, dass sie die um Gnade Flehende nicht nur beschimpft, sondern auch verhöhnt. Maria, ohnehin durch ihre Erniedrigung gereizt, nennt Königin Elisabeth Bastard und Schande für Englands Ehre. Elisabeth eilt tief betroffen und verletzt davon und verkündet zu Leicesters Bestürzung Marias baldigen Tod. 

Elisabeth zögert, das Todesurteil zu unterschreiben, wird jedoch durch Sir Cecil dazu überredet. Als Leicester zu ihr kommt, hält Elisabeth das Urteil triumphierend in der Hand und befiehlt seine Anwesenheit bei der Hinrichtung. Maria nimmt das von Cecil und Talbot überbrachte Urteil furchtlos zur Kenntnis und erhält von Talbot, der unter seinem Mantel einen Priesterrock trägt, die Absolution. Maria verzeiht ihren Feinden und geht beim letzten Kanonenschuss tapfer und gefasst zum Richtblock.