La princesa Isabel y su paje Teobaldo, se han separado del grupo de cazadores en el bosque de Fontainebleau, no lejos de París. El príncipe Carlos, hijo de Felipe II de España, va a contraer matrimonio con ella, y solo manifiesta su alegría. La princesa no conoce a su prometido, y el príncipe se presenta como un miembro del cortejo español, pero pronto se revela como su prometido, y ambos confiesan su mutuo amor. Pero regresan los hombres de España, para traer mensaje del Rey Felipe II, que pide la mano de la princesa Isabel. Isabel debe aceptar el matrimonio, llena de tristeza, por el bien de ambos pueblos. Al tiempo, en el claustro del monasterio de Yuste,  don Carlo lamenta el casamiento de su padre con la mujer que ama. Rodrigo, el Marqués de Posa, recién llegado de Flandes, siente angustia por los problemas de su amigo el príncipe, y así se entera de su amor por su ahora madre. Rodrigo le aconseja abandone Madrid, y que obtenga permiso de su padre para marchar a Flandes y demostrar su valor ayudando al pueblo oprimido de aquellos estados. Ambos jóvenes se juran amistad eterna. De regreso de París, Rodrigo entrega en el jardín a la Reina una carta de su madre y al mismo tiempo desliza entre sus manos una nota de Don Carlo, solicitando verla. La Reina acepta, todos se retiran y llega don Carlo. Pide en principio la ayuda de la Reina para persuadir a su padre lo nombre gobernador de Flandes, pero termina perdiendo el control de sí mismo, declarándole apasionadamente su amor. Ella se aparta, y don Carlo huye precipitadamente. Arriba entonces el Rey, disgustado por ver a la Reina sola, y despide a la Condesa d’Aremberg que debía permanecer como su dama de compañía, enviándola de regreso a Francia. Todos, consternados, se retiran. Pero el Rey le pide a Rodrigo charlar con él. Felipe le ofrece a Rodrigo un favor, a cambio de su servicio en las batallas. Rodrigo pide que libre de su miserable situación a Flandes, donde los protestantes están siendo perseguidos, pero Felipe, inconmovible, solo advierte al Marqués que se cuide del Gran Inquisidor. Sin embargo, el Rey comienza a confiar en Rodrigo y estima su honestidad, confesándole incluso sus sospechas acerca de la relación entre Isabel y su hijo Carlos, pidiéndole a Rodrigo que los vigile de cerca. Don Carlo recibe una nota anónima, señalándole una entrevista en el jardín de la Reina durante un baile de máscaras. El príncipe supone que la nota es de la misma Reina, y se presenta. Llega incluso a declararle su amor a la mujer oculta tras la máscara de la Reina. Pero no se trata de ella sino de la princesa de Éboli. Pronto la princesa se da cuenta que las palabras de éste iban dirigidas a Elisabetta. Furiosa de Celos, la princesa de Ébolli le advierte que está determinada a una dura venganza. Rodrigo llega, intenta aliviar la situación, pero la princesa está ciega de furia. Cuando ella se marcha, Carlos y Rodrigo vuelven a jurarse amistad total, y el príncipe confía a Rodrigo unos documentos secretos, de importancia vital, relacionados con los líderes revolucionarios de Flandes. Poco después, en una plaza frente a la catedral, todo está preparado para un auto de fe. La multitud canta en honor del Rey. Pero llega don Carlo, al frente de una comisión de seis diputados flamenco, y se postran en súplica frente al Rey. Don Carlo se adelanta y pide a Felipe que lo nombre gobernador de Flandes, para probar su capacidad para ser rey en el futuro. Felipe rechaza la petición y don Carlo, fuera de sí, desenvaina su espada en presencia del monarca. Felipe pide desarmen al príncipe, pero nadie se atreve a hacerlo. Después de unos momentos de estupor, es Rodrigo quien desarma a su amigo el príncipe, recibiendo así el título de Duque en reconocimiento. Más tarde en su despacho, el Rey ha mandado a llamar al Gran Inquisidor. Pregunta qué castigo debe administrarse a su hijo, y el Inquisidor le aconseja la pena de muerte, señalando que si Dios sacrificó a su propio Hijo para salvar a la humanidad, él puede sacrificar el suyo para salvar su reino. El Inquisidor pide a Felipe entregue a Rodrigo, sospechoso de conspirar contra la Iglesia, pero el Rey se resiste. Entra entonces Isabel, y pide justicia: le han robado su joyero. Pero el joyero lo tiene el mismo Rey, quien lo abre, encontrando una miniatura del príncipe Carlos. A solas con la Reina, la princesa de Éboli confiesa que ha sido ella quien, por celos, ha entregado el joyero al Rey. Pide perdón a la Reina por su traición, pero no solo le confiesa su amor por Carlos, si no que que ha sido también amante del Rey. Isabel le ordena abandonar la corte, marchándose al exilio o a un convento, dejando sola a la princesa en el despacho del Rey. Allí descubre la órden de ejecución para Carlos, y decide ayudar al príncipe antes de partir de Madrid. En un calabozo, Carlo recibe la visita de Rodrigo. Éste viene a despedirse: la Inquisición encontró los documentos del príncipe en su poder, y lo está buscando. Rodrigo ha hecho esto con la esperanza de salvar a Carlos para que pueda liberar a Flandes. La venganza del Rey y de la Inquisición no se hace esperar, y Rodrigo es herido. En sus últimos momentos, le dice a Carlos que la Reina se econtrará con él al día siguiente. El Rey llega para devolver su espada a don Carlo, pero éste acusa a su padre de ser cómplice de la muerte de Rodrigo, y le revela que en realidad éste ha hecho todo para salvarlo a él. Fuera, se escucha el clamor de la multitud, levantada por la princesa de Éboli, pidiendo la libertad de Don Carlo. Las puertas se abren, la princesa ayuda a escapar al infante, pero el Gran Inquisidor aparece y ordena a la multitud postrarse en homenaje al monarca elegido por Dios. Isabel, invadida de profunda tristeza, espera sola en el Monasterio de Yuste, arrodillada ante la tumba del Emperador Carlos I, la llegada de don Carlo. Finalmente aparece, se despiden tiernamente, reconociendo su mutuo amor, que solo podrá consumarse en otra vida. Pero el rey Felipe y el Inquisidor llegan, junto con la guardia, a buscar a Carlo. Cuando los soldados van a apresar a los enamorados, se abre la tumba del Emperador Carlos y de ella emerge una visión, con hábito de monje, que se lleva a Don Carlos con ella, ante el estupor de todos los presentes.