L'action se passe en 1559 dans la forêt de Fontainebleau, durant la négociation de la paix entre la France et l'Espagne : aux termes du traité, l'Infant d'Espagne, Carlos, épousera Élisabeth de Valois, (Élisabeth de France) la fille du roi de France, Henri II. Dans la forêt de Fontainebleau, les bûcherons et leurs femmes rencontrent la princesse Elisabeth de Valois, fille d'Henri II. Elle les assure que la guerre franco-espagnole, qui les a précipités dans la misère, touche à sa fin, puisqu'un envoyé espagnol vient d'arriver pour négocier le mariage d'Elisabeth avec l'infant Don Carlos, fils de Philippe II. Elle s'en va, suivie par les bénédictions des bûcherons.
Afin de rencontrer sa fiancée, Carlos est venu incognito en France : au cours d'une chasse organisée par le roi, il croise Élisabeth, accompagnée de son seul page Thibault, alors qu'elle s'est égarée. Sous prétexte de l'aider à retrouver le château, Carlos l'aborde et la conversation s'engage entre eux. Élisabeth lui parle de son prochain mariage et de ses craintes quant au fait d'épouser un homme qu'elle n'a jamais vu. Afin d'apaiser ses inquiétudes, Carlos lui montre alors une miniature représentant l'Infant d’Espagne ; à la vue du portrait, Élisabeth reconnait son interlocuteur et une conversation passionné est vite interrompu par l'arrivée de l'ambassadeur d'Espagne en France : ce dernier vient en effet annoncer la décision du roi d'Espagne, Philippe II, qui est veuf, d'épouser lui-même Élisabeth. Bouleversée par le sort du peuple, Elisabeth cède, renonçant à l'amour au nom de la raison d'état.
Un moine est en train de prier près du tombeau de l'empereur Charles Quint, tandis que d'autres frères psalmodient dans la chapelle. Carlos, venu rechercher en ces lieux un apaisement à son chagrin, croit reconnaître la voix de Charles Quint, son grand-père, dans celle du moine en train de prier. Sa méditation est interrompue par l'arrivée de son ami Rodrigue, marquis de Posa : celui-ci rentre des Pays-Bas où il a été témoin des excès de l'occupation espagnole ; il adjure l'Infant d'user de son influence auprès du Roi en faveur des Flamands. Carlos, de son côté, lui confesse son amour pour la Reine, sa belle-mère. Rodrigue lui conseille de s'éloigner de la cour et de partir aider les Flamands. Au moment de se séparer, les deux hommes se jurent une amitié éternelle. Dans les jardins du monastère, les dames de la Cour devisent gaiement. La princesse Eboli, aussi belle qu'intrigante, commence à chanter une chanson. Rodrigue profite de cette réunion pour remettre à la Reine une lettre de sa mère (Catherine de Médicis), lettre à laquelle est joint un billet de Carlos. Il supplie ensuite la Reine d'accorder une entrevue à ce dernier. Celui-ci paraît et s'enflamme mais Élisabeth lui rappelle que, désormais, elle est sa mère. Désespéré, Carlos s'en va. Le Roi arrive ; il s'étonne de voir la reine seule, ce qui est tout à fait contraire à l'étiquette : il décide alors de chasser de la cour d'Espagne la dame d'honneur d'Élisabeth, la comtesse d'Aremberg, qui aurait dû tenir compagnie à la Reine. Rodrigue profite de cette entrevue avec le Roi pour plaider la cause des Flamands. Sensible à la franchise du marquis, le roi se laisse aller à des confidences : soupçonnant une intrigue entre son fils et sa femme, il demande au marquis ne pas les perdre de vue, et lui conseille de se méfier du Grand Inquisiteur. La fête en l'honneur du mariage bat son plein, et Elisabeth, qui ne se sent pas le cœur de rester, demande à Eboli de prendre ses vêtements et de se faire passer pour elle. La princesse espère séduire Carlos et lui déclarer enfin son amour au cours de cette nuit. Dans les jardins de la Reine, Carlos lit une lettre qui lui donne rendez-vous à minuit. Apercevant une femme masquée qu'il croit être la Reine, il se précipite vers elle et déverse des paroles enflammées. Mais il s'aperçoit que c'est la princesse Eboli ; se rendant compte de sa méprise, Carlos ne peut cacher sa déception à la princesse qui jure alors de se venger. Rodrigue tente de la calmer mais en vain. Elle s'en va d'un air menaçant. Le marquis conseille alors à Carlos de lui remettre les papiers compromettants qu'il pourrait avoir en sa possession.
Devant la cathédrale de Valladolid, le Roi, la Reine, la cour, le clergé et le peuple sont assemblés : des hérétiques condamnés par l'Inquisition vont être brûlés. Une délégation de députés flamands, avec Carlos à sa tête, interrompt cette exécution : les députés demandent au Roi de bien vouloir écouter leur supplique. Mais Philippe les fait arrêter ; Carlos, indigné, tire l'épée contre son père, ce qui lui vaut de se faire arrêter par son ami Rodrigue. Le cortège royal repart, tandis que monte la flamme du bûcher.
Philippe II est plongé dans la tristesse de ne pas être aimé de sa femme, lorsqu'on annonce l'arrivée du Grand Inquisiteur : le roi l'a fait venir afin de lui demander s'il peut condamner son fils à mort pour s'être rebellé contre lui ; le Grand Inquisiteur lui répond par l'affirmative et, en contrepartie, réclame au roi la vie de Rodrigue, pour ses idées subversives. Mais Philippe refuse.
Arrive la Reine qui demande justice pour le vol d'un écrin. Philippe le lui tend, l'ouvre et oblige la Reine à reconnaitre le portrait de Carlos sur un médaillon et, devant l'accusation d'adultère, Élisabeth perd connaissance. À l'appel du Roi accourent Rodrigue et la Princesse Eboli. Tandis que Philippe regrette ses soupçons, la princesse avoue à la Reine avoir volé elle-même l'écrin pour la faire accuser d'adultère. Elle confesse avoir elle-même commis le crime dont elle accusait la Reine. Élisabeth lui laisse le choix entre le couvent et l'exil. Rodrigue rend visite à Carlos en prison : il lui avoue qu'il est un homme menacé après que l'on a découvert chez lui les documents compromettants que lui avait remis Carlos. Deux hommes pénètrent alors dans la cellule ; l'un tue Rodrigue d'un coup d'arquebuse ; en expirant, Rodrigue confie à Carlos qu'Élisabeth l'attend le lendemain au couvent de Yuste. Le Roi, escorté du Grand Inquisiteur et des princes, arrive pour délivrer son fils, mais celui-ci le repousse ; on entend sonner le tocsin et le peuple envahit la prison pour délivrer l'Infant. Mais l'intervention du Grand Inquisiteur décourage le peuple, qui finalement se rallie au Roi.
Dans le couvent de Yuste, Élisabeth est en train de prier devant le tombeau de Charles Quint, lorsque Carlos vient lui annoncer son départ pour les Flandres. Ils se disent adieu, au moment où arrive le Roi, accompagné du Grand Inquisiteur : celui-ci veut faire arrêter l'Infant qu'il soupçonne de vouloir soutenir les Flamands. Don Carlo se défend. À ce moment, un moine arrive : il porte la couronne royale et entraîne Carlos dans les profondeurs du cloître ; le Roi et tous ceux présents sont frappés de stupeur en ayant cru reconnaître l'empereur défunt.
