Assur ist es gelungen, Semiramide unter Druck zu setzen, einen Nachfolger Ninos zu ernennen. Er geht davon aus, dass sie sich an die seinerzeitige Absprache hält und ihn zum König macht. Gegen Assur opponieren jedoch Oroe und Arsace. Assur und Arsace konkurrieren zudem um die Liebe der Prinzessin Azema, die auch vom indischen König Idreno umworben wird. Assur glaubt sich als Prinz von göttlichem Blut sowohl des Thrones als auch der Hand Azemas sicher, auf den „Skythen“ Arsace schaut er verächtlich herab. Arsace weiß jedoch, dass Azema ihn liebt.
Semiramide verkündet öffentlich, dass der neue babylonische König auch ihr Ehemann werden soll, was von allen Aspiranten mit Entsetzen aufgenommen wird. Sie nennt den Namen Arsaces und verlangt von Oroe, sie unverzüglich zu trauen. Oroe und Arsace sind gleichermaßen entsetzt, dieser aufgrund seiner Liebe zu Azema und jener, weil er weiß, dass Arsace Semiramides Sohn ist. Assur ist außer sich vor Wut. Idreno nutzt die Gunst der Stunde und bittet Semiramide um Azemas Hand, die diese ihm auch verspricht. Im allgemeinen Chaos erscheint der Geist König Ninos, der verlangt, dass für noch ungesühnte Schuld ein Opfer dargebracht wird. Auch auf Nachfrage äußert er sich nicht konkreter. Alle Anwesenden sind erschüttert, die Heirat von Semiramide und Arsace findet zunächst nicht statt.
Assur macht Semiramide schwere Vorhaltungen ob des gebrochenen Versprechens und sinnt auf Rache. Unterdessen übergibt Oroe in einer geheimen Zeremonie im Tempel Baals Arsace Schwert und Krone König Ninos. Als Arsace dies entsetzt zurückweist, enthüllt ihm Oroe seine wahre Identität ebenso wie die Tatsache, dass Nino von Assur und Semiramide ermordet wurde. Arsace schwört Rache an Assur, fleht aber um Vergebung für seine Mutter. Oroe befiehlt ihm, sich nachts an Ninos Grab einzufinden, dorthin werde ein Gott das Opfer seiner Rache führen.
Arsace bittet Semiramide, Azema heiraten zu dürfen. Semiramide ist jedoch nach wie vor entschlossen, selbst Arsace zu heiraten. Daraufhin enthüllt er ihr, dass er ihr Sohn ist und von der Ermordung seines Vaters weiß. Sie bricht in Tränen aus und bittet ihn, sie zu töten, um seinen Vater zu rächen, was er jedoch verweigert. Assur wartet in der Nähe von Ninos Grab auf Arsace, den er aus Rache für den entgangenen Thron töten will. Semiramide begibt sich ebenfalls dorthin und bittet Ninos Geist um Schutz für Arsace und Vergebung für sich selbst. Arsace trifft mit Oroe, Priestern und Wachen ein; er ist überzeugt, dass Assur das ausersehene Opfer ist. Auf Oroes Anweisung sticht Arsace im Dunkeln zu. Oroe befiehlt, Assur als Ninos Mörder zu verhaften, und verkündet, dass Arsace König Ninia ist. Als Arsace sich wundert, woher das Blut an seinem Schwert stammt, wenn Assur doch noch lebt, muss er unter Assurs Hohngelächter feststellen, dass er seine Mutter getötet hat. Er will sich nun selbst das Leben nehmen, was Oroe und die Priester jedoch verhindern.
