Oroe, gran sacerdote, apprende dal Gran Nume che il regicidio sta per essere vendicato. Successivamente entrano indiani e satrapi per apprendere la designazione del re. Tra questi c'è il principe Idreno, che ama la principessa Azema, ancella di Semiramide. Assur, anche lui innamorato di Azema, è convinto di diventare re, e questo fa indignare Oroe, dato che sa che è coinvolto nel regicidio. Entrata Semiramide, ella si appresta a nominare il nome del re, ma il sacro fuoco si spegne. Oroe spiega che è un segno dello sdegno divino, e afferma che prima di incoronare il re alcune colpe devono essere punite: Assur e Semiramide intendono, spaventati, e la regina si ritira. Nel frattempo entra Arsace , chiamato da Semiramide, intenzionata a volerlo nominare Re; Arsace però è innamorato della bella Azema. Oroe accoglie il giovane e gli annuncia che dovrà vendicare Nino. Assur si irrita per il ritorno di Arsace, dato che anch'egli ama Azema ed afferma che Azema è sua. Intanto Azema viene continuamente corteggiata da Idreno, che teme che ella ami Assur, ma lei lo rassicura affermandogli che non l'amerà mai.
La regina attende l'arrivo dell'amato. Arriva Arsace, che giura eterna fedeltà alla sua regina. Il popolo è radunato nella reggia per attendere l'annuncio del nuovo re. Semiramide esorta tutti a giurare fedeltà ai suoi voti e al nuovo re, e annuncia che l'eletto sarà anche suo sposo: Arsace. Azema è sconvolta, Arsace confuso, Assur indignato; il satrapo ricorda a Semiramide i suoi favori, ma la regina lo minaccia. Idreno allora chiede la mano di Azema, e la regina gliela concede. Mentre Semiramide esorta Oroe a celebrare il rito la terra trema, e si apre il sepolcro dell'imperatore. L'ombra di Nino appare, annunciando che Arsace regnerà solamente quando il suo assassinio sarà vendicato; il giovane giura di uccidere per lui una vittima, ma l'ombra si allontana prima di svelare il nome della vittima. L'atto si conclude nell'unanime turbamento.
Assur è adirato con la Regina, dato che Semiramide ha violato i patti di quindici anni prima: Assur ha cospirato con Semiramide per uccidere il marito Nino. Dopo il regicidio, Ninia, figlio di Nino, vino sottratto da Oroe alle mire di Assur per proteggerlo, e portato dal fratello Fradate. Assur le ricorda la sua colpevolezza, ma Semiramide è rassicurata dai festeggiamenti nella reggia per Arsace, e confida nella sua protezione.
Nel tempio, Oroe mostra ad Arsace la lettera che Nino morente aveva mandato a Fradate, e il giovane capisce di essere lui Ninia. I sacerdoti lo esortano a vendicarsi, sia di Assur che di Semiramide. Arsace vuole vendicare il padre, ma non se la sente di uccidere anche la madre. Azema si rattrista per la sua sorte con Mitrane. Arriva Idreno, che le giura che l'amerà per sempre, e i due si affrettano alle nozze al tempio.
Semiramide raggiunge Arsace, che continua a fuggirla, e gli spiega il motivo del suo turbamento. Semiramide capisce che egli è il figlio di Nino e sa che sta per compiersi il suo destino. Arsace però la rassicura, dicendo che ucciderà solo Assur, e si allontana da lei.
Assur è in preda ad orribili visioni sul fantasma di Nino; entrano i Satrapi che gli comunicano che è caduto in disgrazia presso la regina e tutto il popolo. Dopo un breve momento di delirio, in cui rivede il fantasma di Nino, Assur si dichiara pronto a sfidare la sua sorte. Nel' Interno sotterraneo nel mausoleo di Nino, i magi discendono assieme ad Arsace, per uccidere il traditore. Anche Assur si è nascosto nella tomba, per poterlo uccidere, e scende anche Semiramide, a pregare sulla tomba del marito. Vedendosi, i tre rimangono sconvolti, ed Oroe impone ad Arsace di uccidere Assur. Ma a morire ucciso da lui non è Assur, ma sua madre Semiramide, scambiata per Assur nell'oscurità della tomba. Oroe condanna a morte Assur, ma questi, trionfante, indica il corpo morto della regina; Arsace, sconvolto, fa per suicidarsi, ma Oroe lo ferma, e il popolo entra festante, proclamandolo imperatore.
