In Scozia, in gran parte al castello di Macbeth. Dopo un preludio costruito sulla ripresa di materiale tematico relativo alle streghe e impostato essenzialmente su progressioni di accordi dissonanti che creano un accumulo di tensione che si risolve sul tema del sonnambulismo, l’atto si apre in un bosco percorso da lampi e tuoni, dove alcune streghe riunite in tre crocchi commentano i sortilegi compiuti. Il rullo di un tamburo annuncia l’arrivo di Macbeth e Banco, generali dell’esercito del re Duncano. Le streghe profetizzando salutano Macbeth sire di Glamis, sire di Cawdor e re di Scozia. Macbeth trema e Banco, stupito dalla reazione dell’amico, chiede anch’egli un presagio: sarà meno di Macbeth ma di lui maggiore, più felice e genitore di un re. Arrivano i messaggeri del re, che annunciano a Macbeth di essere stato eletto sire di Cawdor. Banco inorridisce al pensiero che le streghe abbiano detto il vero e Macbeth dà voce ai suoi pensieri di ambizione e morte. Nell’atrio del castello di Macbeth, Lady Macbeth legge una lettera del marito ove egli racconta il vaticinio delle streghe. Lady Macbeth riconosce l’ambizione del marito ma ne paventa la titubanza nel portare a termine l’impresa audace: sarà dunque lei ad accendere il cuore di Macbeth e a istigarlo all’assassinio del re Duncano favorito dal fatto che il re intende trascorrere al castello di Macbeth la notte. In una furibonda cabaletta Lady Macbeth chiama le furie infernali a spingere il marito all’atto sanguinoso. Nonostante le istigazioni della moglie, la coscienza di Macbeth vacilla: inizia ad avere la prima delle visioni che lo segneranno per il corso di tutta l’opera: gli si presenta un pugnale, la lama irrorata di sangue; Macbeth deve agire ed entrato nella stanza del re, lo uccide. Lady Macbeth rientra nella stanza di Duncano per insanguinare le guardie e porre vicino a loro il pugnale che le accusi: Macbeth non può resistere all’orribile spettacolo del proprio misfatto. È ormai mattina presto, Macduff va per svegliare il re mentre Banco dice di aver sentito lamenti e voci di morte nella notte. Alle grida di orrore di Macduff che esce dalla stanza di Duncano accorrono tutti, Macbeth, Lady Macbeth, Malcolm, i servi: il re Duncano è stato tradito e ucciso.
Nella sua stanza, Macbeth teme il vaticinio fatto a Banco: «non re ma di monarchi genitore», per cui decide di uccidere Banco e il figlio Fleanzio. Lady Macbeth ancora una volta invita il marito a essere fermo. Nel parco vicino al castello di Macbeth un gruppo di sicari si riunisce per attaccare Banco e suo figlio, che camminano preoccupati da oscuri presentimenti. Banco viene ucciso mentre Fleanzio fa in tempo a fuggire. Nel frattempo nel castello di Macbeth, davanti a una mensa imbandita, dame e cavalieri salutano Macbeth, che propone un brindisi in onore della moglie; ma il clima di festa è interrotto dall’arrivo di un sicario dal viso sporco di sangue. Macbeth è turbato e inizia a delirare: vede l’ombra dell’amico che gli scuote innanzi i capelli insanguinati, mentre Lady Macbeth sottovoce invita il marito a risvegliarsi. Quando Macbeth ritorna in sé, il banchetto riprende, ma di nuovo appare l’ombra di Banco scacciata violentemente da Macbeth. Lady Macbeth accusa il marito di pavidità e lo invita alla ragione: chi è morto non può più tornare.
In un’oscura caverna, intorno a un calderone che bolle, le streghe preparano una poltiglia infernale. Macbeth viene a interrogarle e le streghe evocano le apparizioni. La prima, una testa coperta d’elmo, dice a Macbeth di guardarsi da Macduff; la seconda, un fanciullo insanguinato, gli dice che nessun nato di donna gli potrà nuocere; la terza apparizione, un fanciullo coronato che porta un ramoscello, dichiara Macbeth invincibile fino a quando non vedrà la foresta di Birnam muoversi. Sfilano quindi i fantasmi di otto re, la stirpe di Banco che regnerà: Macbeth li scaccia e infine sviene. Le streghe invitano gli spiriti aerei a destare il re svenuto. Macbeth rinviene e incita se stesso ad accrescere il proprio potere.
Ai confini della Scozia e dell’Inghilterra, i profughi scozzesi piangono le sorti della patria in mano a un tiranno che la insanguina. L’ultimo eccidio fatto perpetrare da Macbeth è infatti quello dei figli e della moglie di Macduff, il quale ne piange le sorti. Malcolm, alla testa dei soldati inglesi, invita tutti a prendere un ramo e ad avanzare dietro a esso, mentre insieme a Macduff incita alla rivolta contro il tiranno. All’interno del castello, intanto, Lady Macbeth è colta la notte da sonnambulismo: la dama e il medico la vegliano e assistono a un rituale che si ripete uguale: Lady Macbeth si sveglia e rievoca l’assassinio di Duncano, di Banco, di Macduff; affannosamente e invano cerca di pulire le sue mani dalle macchie di sangue. Le truppe nemiche assediano il castello di Macbeth, il quale dichiara di non temere nulla in quanto le streghe hanno vaticinato che nessun nato di donna gli può nuocere; eppure si sente sfuggire la vita ed è consapevole che nessuno onorerà la sua memoria. Rimane fermo anche all’annuncio della morte di Lady Macbeth, ma quando apprende che la foresta di Birnam si muove grida al tradimento e, impugnati spada e pugnale, fronteggia Macduff, al quale rammenta il presagio delle streghe. Vacilla quando Macduff gli dice di non essere nato da donna ma di essere stato tolto dal seno materno, e ferito a morte spira.
