Il principe Tamino, disarmato, è inseguito da un serpente; sfinito e quasi sopraffatto, cade svenuto. Dal tempio escono tre dame velate che uccidono il serpente e, dopo aver ammirato la bellezza del volto del giovane principe, si allontanano per informare della sua presenza la loro signora, Astrifiammante, Regina della notte. Tamino, ripresi i sensi, crede di dovere la propria salvezza a un curioso personaggio comparso nel frattempo: è Papageno, un uccellatore vagabondo vestito di piume, che canta accompagnandosi con un piccolo flauto di Pan. Papageno conferma le supposizioni di Tamino, ma è subito smascherato e punito per la sua menzogna dalle tre dame, che gli chiudono la bocca con un lucchetto d’oro; poi le fanciulle mostrano al principe il ritratto di Pamina, figlia della Regina della notte: il giovane se ne innamora all’istante. Con fragore di tuono appare nel cielo Astrifiammante: ella spiega a Tamino che la figlia le è stata rapita dal malvagio Sarastro e gli chiede di liberarla, promettendogliela in sposa. Le dame donano al giovane, che si è offerto di salvare Pamina, un flauto d’oro dai poteri magici; liberato Papageno dal lucchetto, consegnano anche a lui in dono un carillon fatato e gli ingiungono di accompagnare Pamino nell’impresa. Sala nel palazzo di Sarastro. Pamina, che ha tentato di fuggire per sottrarsi alle insidie del moro Monostatos, viene ricondotta indietro da costui con la forza. Sopraggiunge Papageno, e Monostatos, spaventato dal suo strano aspetto, fugge. Papageno rivela alla fanciulla di essere stato inviato dalla Regina della notte, insieme con un giovane principe che l’ama, per liberarla. I due, pieni di speranza, esprimono la loro fede nella forza dell’amore. Poi si allontanano. La scena si muta in un boschetto. Guidato da tre fanciulli, Tamino giunge dinanzi a tre templi: mentre l’accesso a quelli della Ragione e della Natura gli viene impedito, la porta del tempio della Sapienza arcanamente si apre. Un sacerdote spiega a Tamino che Sarastro non è un essere malvagio e che Pamina è stata da lui sottratta all’influenza materna per superiori, giusti motivi. Rimasto solo, Tamino rivolge il suo pensiero a Pamina. Confortato, trae fuori il suo flauto e suona: subito sbucano fuori animali selvaggi d’ogni specie per ascoltarlo con gioia. Papageno risponde dall’interno col suo piccolo flauto: seguendo i suoni dei rispettivi strumenti Tamino e Papageno, che scorta Pamina, si cercano a vicenda senza tuttavia riuscire a incontrarsi. Il carillon magico di Papageno costringe Monostatos e alcuni servi, che stavano per catturarlo insieme con la fanciulla, a danzare e marciare come automi. Compare Sarastro con il suo seguito: la giovane gli chiede perdono per la fuga, spiegandone i motivi; Sarastro glielo concede di buon grado, ma rifiuta di lasciarla tornare presso la madre. Tamino viene trascinato da Monostatos davanti a Sarastro: il principe e Pamina si riconoscono al primo sguardo e si gettano l’uno nelle braccia dell’altra. Sarastro inopinatamente ordina che Monostatos venga punito per avere insidiato la fanciulla e fa condurre Tamino e Papageno al tempio dell’iniziazione. Tutti inneggiano alla divina saggezza di Sarastro. 

Sarastro chiede ai sacerdoti degli iniziati di accogliere Tamino nel tempio, dove verrà sottoposto alle prove che gli consentiranno di appartenere alla schiera degli eletti e di sposare Pamina: la richiesta viene accolta e tutti invocano Iside e Osiride affinché donino alla nuova coppia spirito di saggezza. Tamino viene condotto nell’atrio del tempio per essere sottoposto alla prima prova: mantenere il silenzio qualunque cosa accada. Con lui è anche Papageno, spaventato e alquanto recalcitrante: solo la velata promessa di ottenere finalmente una compagna riesce in parte a convicerlo. Alla saldezza d’animo di Tamino si oppone lo scetticismo di Papageno: i tentativi delle tre dame, inviate dalla Regina della notte per costringerli a parlare, sono tuttavia respinti e alla prima prova superata Monostatos si avvicina furtivamente a Pamina addormentata: vorrebbe baciarla, ma è cacciato da Astrifiammante che, porgendo un pugnale alla figlia, le ordina di vendicarla uccidendo Sarastro. Monostatos, non visto, ha ascoltato tutto e minaccia di rivelare l’intrigo se Pamina non l’amerà. Sopraggiunge Sarastro: dopo aver scacciato Monostatos, si rivolge paternamente a Pamina e le spiega che solo l’amore, non la vendetta, conduce alla felicità. Sala nel tempio. Tamino e Papageno vengono invitati dai sacerdoti a rimanere ancora in silenzio. Papageno però inizia a conversare con una vecchia che scompare, con fragore di tuono, non appena egli le domanda quale sia il suo nome. Ricompaiono i tre fanciulli, che recano, insieme con gli strumenti di Tamino e Papageno, una tavola imbandita alla quale i due giovani potranno rifocillarsi prima di continuare la prova. Mentre Papageno è felice di mangiare e bere, Tamino, triste, suona il suo flauto. Sopraggiunge Pamina: alla sua gioia di rivedere l’amato, Tamino non può rispondere, e tace. Disperata, Pamina crede di non essere più amata e desidera la morte. Antro delle piramidi. Sarastro esorta i due innamorati a pazientare, giacché altre prove li attendono. Al suono del suo carillon, Papageno medita sulla sua solitudine: cosa darebbe per incontrare una ragazza a cui piacere! Riappare la vecchia, che si rivela essere una bella e giovane Papagena, scomparendo però non appena egli cerca di abbracciarla.

Pamina, credendosi abbandonata da Tamino, tenta di uccidersi, ma è salvata dai tre fanciulli, che la rassicurano sui sentimenti dell’amato. Tamino, scortato da due armigeri, giunge davanti a un cancello al di là del quale si scorgono alte fiamme e una cascata; lo attendono ora le prove supreme del fuoco e dell’acqua. A Pamina, sopraggiunta nel frattempo, è consentito di accompagnarlo. Al suono del flauto magico, le prove vengono superate. Nel giardino, Papageno si dispera perché Papagena è scomparsa. I tre fanciulli gli suggeriscono di suonare il carillon magico: la fanciulla riappare e lo abbraccia. Felici, i due già progettano una stirpe di Papageni. Minacciosi, recando in mano nere fiaccole, Monostatos, la Regina della notte e le tre dame tentano di avvicinarsi al tempio per uccidere Sarastro e i suoi accoliti, ma vengono inghiottiti da un terremoto. Subito tutto viene avvolto dalla luce del sole. Sarastro e i sacerdoti celebrano la vittoria della luce sulle tenebre, mentre Tamino e Pamina vengono accolti nel regno della bellezza e della saggezza.