Elisabetta di Valois, figlia del re di Francia Enrico II, attraversa la scena col paggio Tebaldo e il resto del suo seguito, e getta monete ad alcuni boscaioli che si trovano nei pressi. L'infante di Spagna, Don Carlo, è giunto segretamente in Francia per conoscere Elisabetta, sua promessa sposa: la loro unione suggellerà la pace tra Francia e Spagna, dopo decenni di lotte tra la Casa d'Asburgo ed i Valois. Carlo si trova nella foresta, osserva Elisabetta non visto e se ne innamora. Quando Elisabetta ricompare, avendo perduto la strada per tornare al castello, Carlo inizialmente finge di essere un membro della delegazione del conte di Lerma, ambasciatore spagnolo in Francia. Poi, quando Tebaldo li lascia soli per cercare la strada del ritorno, Carlo annuncia a Elisabetta che le mostrerà il ritratto del futuro sposo: Elisabetta alla vista del ritratto capisce chi ha di fronte, e Carlo le rivela i suoi sentimenti, che lei ricambia. Ma dopo che un colpo di cannone ha annunciato che è stata dichiarata la pace tra Spagna e Francia, il paggio Tebaldo ritorna informando Elisabetta che le è stato chiesto di concedere la propria mano non a Carlo, ma al padre di lui, Filippo II. Giunge anche Lerma, che conferma la decisione di Enrico, sollecitando una risposta da Elisabetta. Elisabetta, pur amando Carlo, si sente tenuta ad accettare, per consolidare la pace. Elisabetta e il corteggio partono, e Carlo rimane solo e disperato.

Il chiostro del convento di San Giusto (San Jeronimo di Yuste), in Estremadura, Spagna. I frati ricordano l'imperatore Carlo V, recentemente scomparso, la cui tomba si trova nel convento; un frate invoca per lui la pace eterna chiedendo che ne venga perdonato l'immenso orgoglio. Compare Carlo, nipote dell'imperatore, angosciato perché la donna che ama, sposandosi con suo padre, è divenuta la sua matrigna. Il frate, in cui Carlo crede di riconoscere la fattezze del nonno, si è fermato ad ascoltarne le parole, e lo ammonisce che solo in cielo potrà trovare pace. Giunge al convento Rodrigo, marchese di Posa, intimo amico di Carlo, che, appresa da quest'ultimo la sua disperata situazione, gli chiede di farsi inviare da Filippo nelle Fiandre, per difendere la popolazione fiamminga oppressa dal duro regime imposto da Filippo. Rodrigo e Carlo si rinnovano la promessa di eterna amicizia. Poco dopo giunge al convento Filippo, conducendo Elisabetta, e alla loro vista si riaccende la disperazione di Carlo.

In un sito ridente alle porte del chiostro di San Giusto, la principessa Eboli è in compagnia di Tebaldo e delle dame della regina, e canta. Giungono anche Elisabetta e Rodrigo. Quest'ultimo, col pretesto di darle una lettera proveniente dalla Francia, riesce a consegnare a Elisabetta un messaggio di Carlo, che la regina legge turbata. Rodrigo implora Elisabetta di acconsentire a un incontro con Carlo. Rodrigo ed Eboli si allontanano chiacchierando. Quando Carlo giunge può restare solo con Elisabetta, e le chiede di intercedere presso Filippo affinché gli conceda di recarsi nelle Fiandre. Elisabetta accetta, ma Carlo non sa dominare i propri sentimenti e le rinnova le proprie dichiarazioni d'amore, poi fugge disperato. Arriva Filippo, che si infuria quando vede che Elisabetta è stata lasciata sola e ne caccia la dama di compagnia, contessa di Aremberg, imponendole di tornare in Francia. Filippo resta solo con Rodrigo, di cui apprezza il carattere e l'audacia, e questi lo implora di concedere la libertà alle Fiandre. Filippo non ascolta la supplica di Rodrigo, ma lo mette in guardia dal Grande Inquisitore, per il quale le idee di Rodrigo costituiscono una grave colpa. Poi Filippo cerca di farsi Rodrigo alleato, confidandogli il sospetto che Carlo stia cercando di strappargli Elisabetta e chiedendogli di sorvegliarli.

NeI giardini della Regina a Madrid, si svolge una festa della regina, ma Elisabetta non se la sente di partecipare e preferisce ritirarsi in preghiera, come ha fatto anche Filippo, che il giorno seguente sarà incoronato re. Per fare in modo che la sua assenza non venga notata, Elisabetta scambia il proprio mantello e la maschera con quelli di Eboli. A mezzanotte Carlo giunge nei giardini. Ha ricevuto un biglietto con l'invito ad un appuntamento, e si presenta credendo che l'invito venga da Elisabetta, mentre in realtà è di Eboli, erroneamente convinta che Carlo sia innamorato di lei. Giunge anche Eboli, velata, che si rende conto che Carlo pensa di trovarsi di fronte alla regina di cui è innamorato. Eboli prima di essere riconosciuta rivela a Carlo di avere udito Rodrigo e il re parlare di lui in modo sinistro, poi giunge lo stesso Rodrigo. Eboli minaccia di rovinarli. Rodrigo fa per pugnalarla ma viene fermato da Carlo; Eboli esce furibonda. Rodrigo chiede a Carlo di affidargli eventuali documenti compromettenti; Carlo, che per qualche istante aveva dubitato della fedeltà dell'amico, si ricrede e acconsente.

Nella piazza si eleva una catasta sulla quale saranno messi al rogo i condannati del Santo Uffizio. Il popolo festeggia, mentre alcuni frati attraversano la scena conducendo i condannati. Segue il corteo reale, e per ultimo il re stesso, che si rivolge al popolo ricordando di avere indossato la corona giurando di dare la morte ai ribelli. Ma subito giunge Carlo, conducendo con sé sei deputati fiamminghi, che si prostrano e implorano da Filippo la pace per il loro paese. Carlo chiede invano a Filippo di divenire reggente del Brabante e delle Fiandre. I popolani e i cortigiani appoggiano le ragioni dei fiamminghi, ma Filippo, spalleggiato dai frati, ordina che i deputati vengano allontanati. Carlo perde il controllo e sguaina la spada minacciando il re stesso, che chiede aiuto, ma i Grandi di Spagna indietreggiano davanti a Carlo. Interviene però Rodrigo, che convince Carlo a riporre la spada. Il re, riconoscente, promuove Rodrigo a duca. Tutti si incamminano per assistere all'auto-da-fè, mentre dal cielo scende una voce a consolare i condannati.

Filippo, come trasognato, medita sul fatto che Elisabetta non lo ha mai amato, e pensa che solo nella tomba che lo accoglierà all'Escorial potrà ritrovare il sonno e la pace. Il conte di Lerma annuncia il Grande Inquisitore, cieco e noventenne: Filippo gli dice che intende mettere a morte Carlo, colpevole di tradimento, e gli chiede se si opporrà a questa decisione. Il Grande Inquisitore lo appoggia, ricordando che anche Dio ha fatto morire il proprio figlio per riscattare l'umanità. Poi il Grande Inquisitore chiede la morte anche di Rodrigo, le cui idee mettono a repentaglio il potere della Chiesa; Filippo tenta inutilmente di opporsi.

Partito l'Inquisitore, entra Elisabetta, a cui è stato sottratto uno scrigno che conteneva oggetti preziosi. Filippo, con espressione terribile, estrae lo scrigno da un cassetto e mostra a Elisabetta che esso contiene un ritratto di Carlo, accusandola di averlo tradito. Elisabetta proclama la propria innocenza, poi, minacciata da Filippo, sviene. Filippo chiede aiuto e accorrono Eboli e Rodrigo. Il re capisce di avere ingiustamente offeso sua moglie; Rodrigo si rende conto che la situazione sta precipitando ed è disposto a sacrificarsi per assicurare un avvenire migliore alla Spagna. Elisabetta rinviene.

Quando i due uomini escono, Eboli confessa di essere stata lei a rubare lo scrigno e consegnarlo a Filippo, accecata dalla rabbia per l'amore per Carlo non corrisposto. Elisabetta la punisce imponendole di scegliere tra l'esilio e la vita in convento. Eboli, rimasta sola, maledice la bellezza che il cielo le ha donato, che la rende altera e dissennata, poi decide che sceglierà il convento, ma prima cercherà di salvare Carlo.

Carlo, accusato di essere agitatore delle Fiandre, è stato imprigionato. Giunge Rodrigo e spiega a Carlo di essere riuscito a salvarlo: ha fatto trovare su di sé i documenti compromettenti che Carlo gli aveva consegnato, attirando su se stesso le accuse rivolte all'amico; per questo Rodrigo sa che presto dovrà morire. Subito dopo un uomo spara a Rodrigo con un archibugio, ferendolo mortalmente. Rodrigo fa in tempo a dire a Carlo che Elisabetta lo attende il giorno seguente a San Giusto, poi muore. Giunge Filippo, per rendere al figlio la libertà. Carlo lo respinge accusandolo di essere colpevole della morte di Rodrigo, di cui mostra il cadavere. Giunge il conte di Lerma annunciando una rivolta popolare per la liberazione di Carlo. Eboli, accorsa mascherata, riesce a liberare Carlo, che il popolo trascina fuori. Filippo affronta i ribelli, che non sembrano temerlo. Soltanto l'intervento del Grande Inquisitore, alla cui autorità la popolazione non osa opporsi, mette fine alla sommossa.

La notte seguente, al chiostro del convento di San Giusto, Elisabetta s’inginocchia presso la tomba di Carlo V, e prega l'anima del vecchio imperatore di intercedere per lei presso Dio e ricorda tristemente le illusioni giovanili dei tempi di Fontainebleau. Giunge Carlo, per un ultimo saluto a Elisabetta prima di separarsi per sempre. Elisabetta esorta Carlo a recarsi nelle Fiandre a far vivere gli ideali di Rodrigo, poi gli chiede di dimenticare ciò che c'è stato tra loro. Mentre si stanno salutando augurandosi di rivedersi nel cielo, vengono sorpresi da Filippo e dal Grande Inquisitore. Il re afferma che ambe due debbono morire. Filippo e il Grande Inquisitore, implacabili, accusano Carlo di tradimento, e quest'ultimo indietreggia verso la tomba di Carlo V. Si apre il cancello della tomba e appare il frate del secondo atto, in cui tutti riconoscono l'Imperatore. Il frate copre Carlo, smarrito, col proprio mantello, e lo trascina con sé, ripetendo che solo in cielo si può trovare pace.