An einem eisigen Winterabend beklagen hungernde Holzfäller im Wald Fontainebleau ihre katastrophalen, durch den Spanisch-Französischen Krieg verursachten Lebensbedingungen. Prinzessin Elisabeth von Valois von Frankreich trifft auf der Jagd mit ihrem Gefolge auf die Hungernden und verkündet ihnen die Unterzeichnung eines Friedensvertrags am selben Abend, der durch ihre Heirat mit Don Carlos, dem spanischen Thronfolger, besiegelt werden soll. Heimlich nach Fontainebleau gereist, wartet Don Carlos im Wald auf seine ihm versprochene Braut, die Prinzessin. Da die beiden sich noch nie gesehen haben, möchte er sie vor der Hochzeit inkognito kennenlernen. Elisabeth, die sich mit ihrem Pagen Thibault im Wald verirrt hat, trifft auf Don Carlos, der sich ihr zunächst als sein eigener Gesandter vorstellt und sich in sie verliebt. Sie ist gespannt auf ihren Verlobten, und als er ihr ein Bild von Don Carlos zeigt, sieht sie, dass er vor ihr steht. Sie gestehen sich ihre Liebe. Thibault, der zum Schloss geeilt ist, um Hilfe für die Prinzessin zu holen, kehrt zurück und grüßt Elisabeth als spanische Königin. Der Graf von Lerma bringt die Nachricht, dass der Frieden zwischen Frankreich und Spanien nur durch eine Hochzeit zwischen ihr und König Philipp, Don Carlos' Vater, gesichert werden könnte. Sie müsse auf der Stelle ihre Zustimmung erteilen. Die verarmte Bevölkerung fleht sie an, der Hochzeit zuzustimmen, doch ihr Herz möchte die eben gefundene Liebe zu Don Carlos behalten. Schließlich haucht sie ein stimmloses „Oui“, das Volk jubelt, aber für Elisabeth und Don Carlos bricht eine Welt zusammen.
Vor dem Kloster von Yuste, in dem das Grab von Kaiser Karl V. liegt, bittet Don Carlos um Vergessen. Seine Verlobte Elisabeth hat seinen Vater geheiratet, er aber kann seine Liebe zu Elisabeth nicht verdrängen oder gar vergessen. Der Marquis von Posa, Rodrigue, kommt dazu und erzählt seinem Freund Don Carlos von den unsäglichen Zuständen in Flandern. Carlos erleichtert ihm sein Herz, er erzählt von seiner unerfüllbaren Liebe zu seiner Stiefmutter. Rodrigue schlägt Carlos vor, seine Sorgen in Flandern beim Kampf gegen die Unterdrückung zu vergessen. Sie schwören einander ewige Freundschaft.
Im Garten des Klosters von Yuste vertreiben sich die Hofdamen der Königin mit der Prinzessin Eboli, die in Don Carlos verliebt ist, die Zeit mit Gesängen. Rodrigue gibt der Königin einen Brief ihrer Mutter aus Paris, dazu heimlich eine Notiz von Don Carlos. Darin bittet Carlos Elisabeth, dem Überbringer zu vertrauen, außerdem bittet er um ein Gespräch. Elisabeth stimmt zu. Don Carlos bittet Elisabeth, auf seinen Vater Einfluss zu nehmen, der ihm einen Einsatz in Flandern verweigert. Doch dann übermannt ihn seine Liebe, er fällt ihr zu Füßen, doch als er versucht, sie zu umarmen, stößt sie ihn weg und meint, er müsse seinen Vater töten, um sie zu bekommen. Philipp erscheint, nachdem Carlos verstört weggelaufen ist. Verärgert darüber, die Königin entgegen dem höfischen Protokoll alleine anzutreffen, verbannt er die verantwortliche Gräfin von Aremberg zurück nach Frankreich. Elisabeth, entsetzt über diese öffentliche Beleidigung, nimmt traurig Abschied von ihrer engsten Vertrauten. Als sich der Hofstaat zerstreut hat, hört sich der König den liberalen Rodrigue an, der mit ihm die Geschehnisse in Flandern besprechen will. Philipp beharrt auf seiner harten Hand, um die Kontrolle in Flandern zu behalten, doch er bewundert insgeheim Rodrigue für seine moderne und offene Art. Er macht sich Rodrigue zum Vertrauten und bittet ihn, ein Auge auf Don Carlos zu haben, doch warnt er ihn auch vor dem Großinquisitor.
Philipps Krönungsfeierlichkeiten gehen ihrem Höhepunkt entgegen. Elisabeth tauscht mit Prinzessin Eboli die Masken, um sich dem Trubel entziehen zu können. Don Carlos erscheint und gesteht der vermeintlichen Elisabeth erneut seine Liebe und ist entsetzt, als er feststellt, dass es sich um Eboli handelt. Eboli versteht die wahren Hintergründe und will ihn denunzieren. Plötzlich erscheint Rodrigue, der droht, die Prinzessin zu erdolchen. Don Carlos kann ihn jedoch davon abbringen. Rodrigue bittet Carlos, ihm verräterische Papiere zur Situation in Flandern auszuhändigen. Der zögert, weiß er doch, dass Rodrigue Vertrauter des Königs ist, lässt sich aber schließlich doch von der Treue seines Freundes überzeugen.
In einer großen Zeremonie, dem Autodafé, werden als Höhepunkt der Feierlichkeiten Verräter und der Inquisition anheim fallende Ketzer verbrannt. Sechs flandrische Gesandte bitten um Gnade für ihr Land, die Bitte wird von Elisabeth, Rodrigue und Carlos unterstützt. Dieser erneuert seinen Wunsch, nach Flandern gehen zu dürfen. Als Philipp ablehnt, zieht Carlos das Schwert gegen den König, keiner wagt einzugreifen. Schließlich ist es Rodrigue, der Carlos die Waffe abnimmt, um Schlimmeres zu verhindern. Der König ernennt ihn zum Herzog, Don Carlos wird verhaftet. Das Autodafé beginnt.
Im Arbeitszimmer sinniert der König über seine Sterblichkeit, seine Einsamkeit und sein Verhältnis zu seiner Frau Elisabeth, die ihn noch nie geliebt hat. Der blinde Großinquisitor erscheint und gibt dem König den Rat, Rodrigue der Inquisition zu übergeben, da dieser mit seinen liberalen Ansichten eine viel größere Gefahr darstelle als Don Carlos. Der König wehrt sich, da er Rodrigue als gleichrangigen Menschen, ja als Vertrauten, den einzigen, den er besitzt, ansieht. Doch der Großinquisitor, allem Irdischen längst entflohen, warnt Philipp, dass auch Könige sich vor der Inquisition verantworten müssen.
Elisabeth beklagt sich vor dem König über den Diebstahl einer ihr wichtigen Schatulle mit persönlichen Dokumenten. Sie reagiert entsetzt, als der König ihr die Schatulle präsentiert, die er von Eboli erhalten hat. Als Philipp sie gewaltsam öffnet, findet er ein Bild von Don Carlos darin. Er beschuldigt sie der Untreue und verflucht sie. Als Rodrigue und Eboli zu Hilfe eilen, erkennt Eboli ihre Schuld, Rodrigue schilt den König ob seiner Unbeherrschtheit. Eboli gesteht der Königin nicht nur den Diebstahl, sondern bezichtigt sich auch des Ehebruchs mit dem König und gesteht ihre Liebe zu Don Carlos. Die Königin befiehlt ihr, den Hof am nächsten Tag zu verlassen. Allein gelassen, will Eboli als letzte gute Tat Don Carlos retten.
Rodrigue besucht Don Carlos im Gefängnis, um ihm Lebewohl zu sagen, denn die Papiere, die bei ihm gefunden wurden, verraten seine Schuld. Durch einen Schuss aus dem Hinterhalt wird Rodrigue tödlich getroffen. Sterbend teilt er seinem Freund noch mit, dass Elisabeth beim Kloster St. Juste auf ihn warte. Eboli hat das Volk mobilisiert, um Don Carlos freizulassen, doch der Aufstand wird durch den Großinquisitor und Philipp beendet.
Vor dem Grab Karls V. treffen sich Elisabeth und Don Carlos. Er hat das Träumen aufgegeben und will versuchen, Flandern zu retten. Sie sagen sich ein letztes Mal Lebewohl. Die beiden werden von Philipp und dem Großinquisitor erwischt. Bevor Don Carlos jedoch ausgeliefert werden kann, erscheint ein alter Mönch und zieht ihn in das Dunkel des Klosters zurück. Voll Erschütterung meinen alle, die Stimme Karls V. gehört zu haben.
