La mort de Mitridate vient juste d’être annoncée. Arbate, le gouverneur de Nymphée, un port de la Tauride, tend les clés de la ville à Sifare, le fils de Mitridate. Sifare avoue son amour pour Aspasia, promise à Mitridate, son dégoût pour son frère, Farnace. Aspasia cherche la protection de Sifare contre Farnace qui a déclaré son intention de se marier avec elle sans délai. Sifare ne peut pas cacher son amour pour Aspasia et elle lui demande d’être patient et de la protéger, le remplissant d’espoir. Farnace arrive et les deux frères se querellent. Ils sont interrompus par Arbate, qui apporte des nouvelles du retour de Mitridate. Farnace tente d’obtenir l’aide de son frère pour s’opposer à Mitridate par la force. Sifare refuse. Farnace dit au tribun romain sa haine pour son père, Mitridate. Il attend avec impatience l’arrivée des troupes de Rome qui l’aideront à usurper le trône de son père.
Mitridate arrive, accompagné par Ismene, fille du roi des Parthes. Il annonce une nouvelle alliance, qui sera scellée par le mariage de Farnace et d’Ismene. La réaction de Farnace rend Mitridate soupçonneux, et il questionne Arbate sur les réactions de son fils à l’annonce de sa mort. Arbate admet que Farnace s’est proclamé lui-même roi et qu’il a l’intention d’épouser Aspasia. Arbate parle de la fidélité et du courage de Sifare. Resté seul, le roi se réjouit que son fils favori soit resté fidèle, jurant de se venger de Farnace.
Ismene reproche à Farnace son infidélité. Mitridate fait venir Aspasia et annonce que leur mariage sera célébré le jour même. Seuls, Sifare et Aspasia déclarent leur amour mutuel. Arbate arrive et annonce que Mitridate demande la présence de son fils à son camp. Tourmenté par le conflit entre le devoir et son amour, Aspasia demande à Sifare de s’éloigner. Mitridate annonce son intention d’aller livrer bataille contre les Romains. Farnace essaie de persuader son père que les Romains veulent la paix et, convaincu de la trahison de son fils, Mitridate fait emprisonner Famace. Famace révèle alors que Sifare et Aspasia s’aiment. Mitridate décide de tester Aspasia. Il lui dit qu’il renonce à elle et poussée à ses limites, Aspasia avoue. Furieux, Mitridate jure qu’elle et son fils mourront. Aspasia supplie Sifare de la tuer en châtiment mais Sifare lui dit d’implorer la grâce du roi. Elle refuse. Mitridate est résolu à se venger. Ismene lui conseille de se comporter en amoureux plutôt qu’en souverain. Mitridate propose à nouveau le mariage à Aspasia. Elle le repousse, offrant sa vie en échange du pardon pour Sifare. Mitridate se résout à les tuer tous les deux. À ce moment, Arbate arrive avec la nouvelle du débarquement de la flotte romaine. Aspasia décide de se tuer mais Sifare l’en empêche. Il lui demande d’attendre son retour et part rejoindre son père contre les Romains.
Famace est en prison, quand Marzio, accompagné par des soldats romains, arrive pour le libérer. Marzio dit à Farnace la déroute de Mitridate et lui promet le trône. Laissé seul, Farnace est submergé par le remords et décide d’agir honorablement. Blessé à mort, Mitridate appelle Sifare à son côté et le remercie pour sa bravoure et sa loyauté et lui confie Aspasia. Ismene entre et annonce que c’est Farnace qui a mis le feu à la flotte romaine. Mitridate lui pardonne et meurt. Sifare, Aspasia, Farnace, Ismene et Arbate proclament leur intention de se battre ensemble contre les Romains.
