Vor dem Dogenpalast in Venedig drängt sich an einem Frühlingstag die Menge; die jährliche Regatta findet statt. Barnaba, ein Spitzel der Inquisltion, hat sich unter das fröhlich tanzende Volk gemischt und macht der jungen schönen Strassensängerin Gioconda, die ihre blinde Mutter führt, mit unverschämten Worten den Hof. Gioconda weist Barnaba schaudernd zurück und geht davon. Sie erwartet an diesem Tag Enzo, der, aus Venedig verbannt, als dalmatinischer Schiffskapitän verkleidet zum Fest gekommen ist. Enzo liebt nicht Gloconda, sondern Laura, die er in Venedig kennengelernt hat und die ihm von Badoero, dem mächtigen Staatsbeamten, weggenommen wurde. Rachsüchtig versucht Barnaba, die Menge gegen Giocondas Mutter aufzuhetzen, indem er dem Verlierer der Regatta, Zuane, einredet, dass die Blinde sein Boot verhext hat.
Leicht finden seine Worte Glauben. Wütend stürzen sich Zuane und seine Freunde auf die vermeintliche Hexe, um sie zu verbrennen. Enzo entreisst die Blinde dem Volk, doch Barnaba beschuldigt sie nochmals bei Badoero, der gerade mit Laura den Dogenpalast verlässt. Laura überzeugt ihren Gemahl davon, dass eine Hexe niemals einen Rosenkranz trage, worauf sie Badoero freilässt. Die Blinde schenkt ihren Rosenkranz Laura, die Enzo sofort erkannt hat. Auch Barnaba weiss von Lauras Verhältnis zu Enzo und schlägt diesem vor, sich mit seiner Geliebten an diesem Abend auf Enzos Schiff zu treffen. Er hofft dadurch, Gioconda zeigen zu können, dass Enzo sie nicht liebt, um sie für sich zu gewinnen. Enzo geht auf den Handel ein. Kaum ist er gegangen, als der Spitzel seinem Schreiber Isepo einen Brief an Alvise Badoero diktiert und mitteilt, dass Enzo mit Laura in dieser Nacht aus Venedig fliehen werde. Diesen Brief steckt er in das berüchtigte "Löwenmaul" im Hof des Dogenpalastes, in dem alle anonymen Anschuldigungen an die Inquisition hinterlegt werden. Gioconda, die alles zufällig mithören konnte, ist entschlossen, ihrem Geliebten zu helfen.
Unter den Augen von Barnaba, der sich als Schiffer verkleidet hat, wird Enzos Schiff von den Matrosen zum Auslaufen fertiggemacht. Enzo tritt aus der Kajüte, in Erwartung seiner Geliebten, dann wird Laura von Barnaba an Bord gebracht. Enzo und Laura schwören sich ewige Liebe und machen sich zur Flucht bereit. Plötzlich, während Enzo das Schiff überprüft und Laura die Jungfrau Maria um Kraft bittet, steht Gioconda vor Laura; ein heftiger Streit entsteht. Gioconda versucht, ihre Rivalin zu erstechen, erkennt aber bei Laura den Rosenkranz ihrer Mutter und sieht ein Boot mit Badoero nahen. Sie nimmt Laura, nachdem sie Enzo von Barnabas Verrat unterrichtet hat, in ihrem Boot mit davon. Badoero und Barnaba verfolgen die Flüchtigen vergebens und schwören Rache. Kriegsgaleeren greifen Enzos Schiff an. Der Kapitän lässt Feuer legen und flieht, um seiner Geliebten zu helfen.
Badoero hat beschlossen, seine treulose Frau zu töten. Er zwingt sie, in einer vorbereiteten Kammer in seinem Palast, der Ca d'oro am Canale Grande, Gift zu nehmen, während seine Gäste einer Serenade zuhören. Gioconda, die Schlimmes vorausgeahnt hat, ist es gelungen, in den Palast einzudringen und das Giftfläschchen mit einem Betäubungstrank, der zum Scheintod führt, zu vertauschen. Höhnisch zeigt Badoero den Gästen, unter denen auch Enzo ist, seine tote Frau. Enzo stürzt sich auf den Mörder, wird aber von den Wachen überwältigt. Gioconda bietet Barnaba an, ihm zu gehören, wenn er Enzo rette. Der Spitzel triumphiert, lässt aber, um sicher zu gehen, Giocondas Mutter festnehmen.
Giocondas Freunde haben die immer noch bewusstlose Laura aus dem Grabgewölbe geholt und zu Giocondfas Behausung, einem geheimen Platz auf der Insel Giudecca, gebracht. Giuoconda hält das Gift, das Alvise seiner Frau aufzwang, in Händen, verzweifelt und schwankend, ob sie sich töten oder Laura, die nun ganz in ihrer Hand ist, in den Kanal Orfano stossen soll. Enzo, von Gioconda informiert, stürzt herein und kann nicht glauben, dass Gioconda Lauras Leichnam hierher bringen liess. Wegen dieser abscheulichen Tat zieht er den Dolch. In diesem Augenblick erwacht die »Tote«. Enzo und Laura erfahren endlich, was Gioconda für sie gewagt hat. Sie wünschen Gioconda Glück und Segen und können nicht wissen, was die Sängerin erwartet; sie fliehen ungehindert. Kurz darauf stürzt Barnaba herbei, um seinen Lohn zu fordern. Es gelingt Gioconda, ihn für einen Augenblick abzulenken, indem sie vorgibt, sich für ihn schmücken zu wollen. Gioconda stösst sich den Dolch ins Herz und hört nicht mehr, dass ihr Barnaba höhnisch ins Ohr schreit, ihre Mutter erwürgt zu haben.
