Galleria nel palagio di Westminster, festosa di cortigiani in attesa della regina che infatti non tarda ad arrivare. Elisabetta è però perplessa: ha ricevuto una proposta di matrimonio da parte del re di Francia, ma è in realtà innamorata del conte di Leicester. Lord Talbot le ricorda l’infelice sorte della regina di Scozia, Maria Stuarda, tenuta prigioniera nel castello di Forteringa; Lord Cecil, invocando la ragion di stato, le consiglia invece di essere impietosa con la sua nemica. Arriva Leicester che, dopo una breve scena con la sospettosa e gelosa Elisabetta, resta solo con Talbot. Quest’ultimo gli racconta di essere stato da Maria e di aver ricevuto un ritratto e una lettera per lui. Leicester è turbato e commosso: ama infatti segretamente la regina di Scozia. Sta per uscire di scena quando incontra Elisabetta: egli cerca di intercedere a favore della Stuarda, ma riesce solo a esasperare la gelosia della regina, che accetta però di incontrare personalmente la nemica. Parco di Forteringa. Controllata a vista dalle guardie, Maria Stuarda respira un po’ di libertà nel parco di Forteringa, invocando nostalgicamente la giovinezza e i «bei lidi di Francia» ormai lontani. Di colpo si odono un coro e una fanfara di caccia: Elisabetta e il suo seguito si avvicinano. Un duetto tra Leicester e Maria ritarda ancora l’incontro fatidico tra le due regine. Ma ecco che entra Elisabetta con il folto seguito di cortigiani. Costei tratta con orgoglioso disprezzo la rivale che pure si era prostrata ai suoi piedi. Maria allora si alza e reagisce insultando davanti a tutti la regina. L’offesa è tale da rendere ormai inevitabile la condanna a morte della Stuarda.
Galleria nel palagio di Westminster. La regina è ancora dubbiosa; Cecil cerca invano di convincerla a firmare la condanna: Elisabetta sembra riluttante e confusa. Ma, appena vede entrare Leicester, allora firma il foglio di scatto e lo consegna a Cecil. All’ultimo tentativo del conte, che cerca di convincere la regina a concedere la grazia, Elisabetta risponde furente disponendo che Leicester debba assistere all’esecuzione. Appartamento della prigione di Maria Stuarda nel castello di Forteringa. Maria aspetta la sentenza nella sua prigione. Entrano Cecil e Talbot: il primo reca la sentenza di morte, il secondo porta un po’ di conforto spirituale alla condannata. Durante il suo duetto con Talbot, la regina di Scozia confessa i suoi peccati e si dispone a morire cristianamente. Sala attigua al luogo del supplizio. Il momento del supplizio è giunto. Un coro funebre prepara l’entrata della condannata che compare in scena «vestita di nero, in gran pompa, ornata della sua corona». Segue una preghiera cantata da Maria e dal coro. Quando Cecil chiede alla condannata quale sia il suo ultimo desiderio, la Stuarda risponde di voler solo il perdono di tutti i suoi nemici: dal cielo implorerà il favore divino per l’Inghilterra. Entra Leicester disperato e pieno di rabbia verso Cecil e i presenti. Maria lo rasserena chiedendogli di rinunciare a ogni vendetta e di guidarla lui stesso al patibolo.
