Der Prolog tritt vor den geschlossenen Vorhang und heißt das Publikum mit einer Rede über die Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen Schauspiel und Realität willkommen. Im Namen des Librettisten und Komponisten bereitet er die Zuschauer auf ein besonders realitätsnahes Stück vor. 
Mit seiner Commedia dell’arte-Truppe zieht Canio ins Dorf und lädt die jubelnde Menge zur Abendvorstellung ein. Als die Komödianten ins Wirtshaus eingeladen werden, entschuldigt sich Tonio, er müsse noch den Esel versorgen. Die Neckereien der Bauern, er wolle wohl mit der hübschen Nedda allein bleiben, lösen bei deren eifersüchtigem Mann Canio einen Wutausbruch aus, und er verkündet, anders als auf der Bühne würde er im echten Leben Untreue mit dem Tode rächen. Von diesen Worten tief beunruhigt bleibt Nedda, deren Gewissen gar nicht rein ist, zurück und besingt neidisch die Freiheit der Vögel. Tonio nähert sich und macht ihr Avancen, die sie spottend zurückweist. Nachdem sie ihn mit einer Peitsche in die Flucht geschlagen hat, tritt Neddas Geliebter Silvio auf, der sie überreden will, mit ihm in der Nacht zu fliehen. Tonio hat die beiden beobachtet und alarmiert Canio. Silvio kann in letzter Sekunde unerkannt fliehen. Mit dem Messer drohend, verlangt Canio von Nedda den Namen des geflohenen Geliebten, doch Beppo kommt dazwischen und kann Canio zunächst mit der Begründung, die ersten Gäste seien bereits kurz vor dem Eintreffen, zur Vernunft bringen. Vor der Vorstellung sammelt Nedda das Eintrittsgeld und warnt dabei heimlich den tatsächlich anwesenden Silvio vor Canios Zorn. Die Aufführung beginnt: Von ihrem Mann "Pagliaccio" (Canio) alleingelassen, wartet "Colombina" (Nedda) auf ihren Geliebten "Arlecchino" (Beppo), doch "Taddeo" (Tonio) platzt hinein und will sich ihr nähern. "Arlecchino" verjagt ihn, und die beiden Liebenden setzen sich zum Essen. Da kommt "Pagliaccio" nach Hause, und als Nedda dem fliehenden "Arlecchino" die gleichen Abschiedsworte nachruft wie am Nachmittag ihrem Silvio, verliert Canio/Pagliaccio die Contenance: Indem er Spiel und Ernst zu vermischen beginnt, fragt er Nedda erneut nach dem Namen seines Nebenbuhlers. Die Zuschauer sind hingerissen von dieser Intensität und applaudieren dem so real wirkenden "Spiel". Erst als Canio der fliehenden Nedda ein Messer in den Rücken sticht und ihr letzter Seufzer "Silvio!" erklingt, erkennt das Publikum den Ernst der Lage, doch zu spät: Auch der Geliebte wird vom rasenden Ehemann erstochen.